3T3-L1细胞实验操作.pdf

3T3-L1 细胞实验操作3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪）培养基配制（准备 1L 高压过的超纯水）1、DMEM 粉倒入 1L 放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40 分钟2、擦净，加入 3.7g Na2CO3，盖锡纸磁力搅拌10 分钟3、称 2.38g HEPES （4℃保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装， 4℃保存，用时加 10ml 血清配成 10%FBS 顺便先配诱导液：配好的培养基分装入100ml 瓶中， 90mlDMEM准备好 FBS 、IBMX 、DEX 、insulin（2μg/ml ）先配两瓶 100ml 10%FBS ，A液：IBMX 1ml + DEX 100μl + insulin 250μl 入 100ml 10%FBS B液：insulin 250μl 入 100ml 10%FBS （先过滤）细胞冻存（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准备 DMEM （分装好的） * 1 瓶，50 ml 瓶 * 2 ，针，过滤器 * 1 ，DMSO 试剂，冻存管。

2、配冻存液（ 10ml）：按 5：4：1 比例→ 培养基 5ml ：血清 4ml ：DMSO 1ml ，混匀3、拿出一个新的、 标记好用 针筒 把 过滤器 弄在 瓶口 用 针筒 吸 新配的冻存液， 把针头 摘掉，经 过滤器 把 新配的冻存液滤到新瓶4、PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）5、吸 胰酶 500μl （吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）6、大皿加入 2~3ml 冻存液，打圈吹散，分装1ml 至冻存管，勿离心7、-4℃ 30min ，-20℃ 1h ，-80℃ 2h ，最后液氮冻存一、细胞复苏（准备 10%FBS、晚上复苏）1、将从液氮取出冻存管放入37℃恒温水箱搅拌解冻2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入5~6 ml10%FBS ，混匀3、培养过夜后进行换液二、细胞传代（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）10%FBS 即 90mlDMEM + 10ml血清 半个月内用完1、缓慢吸走旧培养基，换枪头，用2ml DMEM 清洗，后吸弃2、加 500μl 胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶3、加入 2ml10%FBS ，打圈混匀，吸 1ml，每皿大概 5~6 滴入新的培养皿（大皿10 滴~1ml），其余弃掉，后加 3ml10%FBS （大皿 8ml），大概可 2 天传代。

4、换液时需缓慢吸弃旧培养基，DMEM 清洗细胞（注意换枪头杜绝污染）后吸弃，10%FBS 贴壁加入 3ml三、细胞接板（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）24孔板： 560μl 细胞+6ml 10%FBS （12 个样）【600μl 分化 1.2ml 增殖】12孔板： 1400μl 细胞+11ml 10%FBS 用 25ml 瓶一板对一瓶装1、准备好 12 孔板、 24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、 25ml 瓶 4 个、软管2、配 10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清3、第一二瓶各 6ml 10%FBS ，第三四瓶各 11ml 10%FBS 4、吸弃旧培养基，加2ml DMEM 摇晃清洗，吸弃， 500μl 一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞分散开来即停止消化5、每皿加入 2ml 10%FBS ，1ml 枪头打圈吹散6、将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散7、560μl 细胞分别加入一二瓶混匀，1400μl 细胞分别加入三四瓶混匀8、一二瓶对应加 500μl 细胞进 24 孔板（加 12 个孔）摇晃混匀，三四瓶对应加 1ml 细胞进 12 孔板，摇晃混匀。

放培养箱，第二天进行转染 四、细胞转染（无酶 EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准 Opti-MEM ，灭菌水， mic（inhibitor），NC ，Lipo3000，无酶 EP管、无酶小管， 96 孔枪头板， 12孔板、 24 孔板各 2 板（工具照紫外）2、NC 、mic（inhibitor）4℃ 1500r 1.5min离心3、分装 Lipo3000 tube管 150μl 一管（轻混）， mic（inhibitor）、 NC 小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好4、分装 Opti-MEM 20ml 入瓶待用5、计算好体系： (n 为样品数量， N为总样品数量）Mic：①45μl + 600 μl Opti-MEM （12 孔板） --- 3.75 μl Mic * n + 50μlOpti-MEM * n ；②22.5 μl + 300 μl Opti-MEM （24 孔板 12 个样）---1.875μl Mic * n + 25μlOpti-MEM * n NC ：③45μl + 600 μl Opti-MEM （12孔板） --- 3.75 μl NC * n + 50μlOpti-MEM * n ；④22.5 μl + 300 μl Opti-MEM （24 孔板 12 个样）---1.875μl NC * n + 25μlOpti-MEM * n LP：⑤84μl + 1200 μl Opti-MEM （12 孔板） --- 3.5 μl LP * N + 50μlOpti-MEM * N ；⑥36μl + 600 μl Opti-MEM （24 孔板 12个样） ---1.5μl LP * N + 25μlOpti-MEM * N Inhibitor：①90μl + 600 μl Opti-MEM （12 孔板） --- 7.5 μl inh * n + 50μlOpti-MEM * n ；②45μl + 300 μl Opti-MEM （24 孔板 12 个样） --- 3.75 μl inh * n + 50μlOpti-MEM * n NC ：③90μl + 600 μl Opti-MEM （12孔板） --- 7.5 μl NC * n + 50μlOpti-MEM * n ；④45μl + 300 μl Opti-MEM （24 孔板 12个样） --- 3.75 μl NC * n + 50μlOpti-MEM * n LP：⑤84μl + 1200 μl Opti-MEM （12 孔板） --- 3.5 μl LP * N + 50μlOpti-MEM * N ；⑥36μl + 600 μl Opti-MEM （24 孔板 12个样） ---1.5μl LP * N + 25μlOpti-MEM * N 6、标记好 tube 管：①mic 45 μl + 600 μl ；②mic 22.5 μl + 300 μl ；③NC 45μl + 600 μl ；④NC 22.5μl + 300 μl ；⑤LP 84μl + 1200 μl ；⑥LP 36μl + 600 μl 。

①in 90 μl + 600 μl ；②in 45 μl + 300 μl ；③NC 90μl + 600 μl ；④NC 45μl + 300 μl ；⑤LP 84μl + 1200 μl ；⑥LP 36μl + 600 μl 注意： LP 需轻轻混匀，⑤平均分至①③；⑥平均分至②④，加后轻轻混匀静置 5min，拿出接板后的12孔板、 24 孔板细胞观察7、将旧培养基吸弃，12孔板 每孔 1ml Opti-MEM + 100μl 转染液； 24 孔板 每孔 500μl Opti-MEM + 50μl 转染液（ 12 个孔）8、加完晃匀， 6h 后换 10%FBS ，放培养箱 42h 后换诱导液开始进行诱导五、细胞诱导分化（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）配置储备液：IBMX(异丁基 - 甲基- 黄嘌呤 ):分子量： 222.2g/mol （Sigma:I5879 ）-20℃保存（难溶最后溶）用二甲基亚砜 DMSO 配制 111.1mg/ml（0.5mol/L ）储存液即：0.0115g IBMX + 940 ul ddH2O + 60 ul KOH 需用滤嘴过滤至新瓶子终浓度为 0.5mmol/L。

现配现用）DEX ：分子量： 392.5g/mol （Sigma:D4902）-20℃保存用无水乙醇配制 1mg/ml(2.5mmol/L) 储存液即： 0.2mg DEX + 0.5ml 无水乙醇终浓度为 1umol/LInsulin：25mg Insulin + 12.5ml HCl 溶解后过滤， PCR 小管分装，终浓度为 2ug/ml ，-20℃保存1、待 3T3-L1 细胞在 24 孔板，毎板 100μl 原细胞体积 +400μl 10% FBS 养 2 天长满，配制诱导液 诱导 3T3-L1 分化先配好 10%FBS 两瓶 100ml 的）2、将旧培养液软管吸弃， PBS清洗，吸弃 PBS ，加入配制好的诱导液I 每孔 500μl 于 24 孔板中，培养 2 天3、将培养液软管吸弃， PBS清洗，吸弃 PBS ，用 200ul 的枪头慢慢 加入配制好的诱导液II 每孔500μl 于 24孔板中，培养 2 天4、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃 PBS ，用 10%FBS 培养基培养 2 天5、细胞油红 O染色的操作步骤：①、10% 中性甲醛的配制材料：中性甲醛 ( 多聚甲醛 ) 密封瓶。

方法：称取 1g 中性甲醛粉末，加入 10ml 的超纯水中，密封，在 60 度水浴中过夜才能溶解配好的溶液 1 个星期内有效，最好4 度保存②、染色液的配制材料：油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴方法：称取预先研磨粉碎的0.5g 油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，60℃水浴溶解，棕色瓶密封 ( 或锡箔纸包裹避光 )4 ℃保存，为储存液， 可长期保存 用时取 6ml 加超纯水4ml 混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完1、吸弃培养基，用PBS洗 2 遍，加入 10％的甲醛固定 30min~1h（贴壁加），期间过滤油红2、吸弃 10% 甲醛，用超纯水洗2 遍，60% 异丙醇孵育 5min3、吸弃 60% 异丙醇，均匀覆盖oil red O染 20min（6 孔板 2ml ，12 孔板 1ml ，24 孔板 500μl ）4、吸弃 oil red O 后，用超纯水洗 2~5遍，直至无污点5、加苏木精孵育细胞1min，吸弃苏木精，超纯水2~5遍6、在细胞上加超纯水观察若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列实验：流式细胞术：（无酶枪头、 1.5mltube 管）注意用前灭菌1、准备接板好的 12 孔板细胞、无酶枪头、 tube 管、96 孔板。

2、摆好 12 个 tube 管，把原来 1ml 10%FBS 培养基吸至 tube 管，一组一枪头，吸1ml PBS清洗细胞（悬空加）吸弃 PBS，一组一枪头，吸 100~150μl 胰酶消化细胞（两排两排消化），显微镜观察第一个， 吸弃胰酶， 将原培养基从 tube 管一一对应吸回去12孔板，并吹匀细胞， 轻轻吹打显微镜观察是否吹匀3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube 管，一对一， 3000g 离心 5min4、吸上清，留沉淀，大概留50μl ，调 950μl 吸弃上清5、悬空加入 4℃冷却的 PBS 1ml，吹匀细胞，3000g 离心 5min，吸弃 PBS （950μl+50 μl 两次 小心吸弃）6、加 300μl4 ℃冷却的 PBS ，吹匀细胞，避免成团7、缓慢悬空加入 700μl 预冷的 70% 无水乙醇，轻轻吹打均匀，4℃保存（可一周）PI 染色：1、准备好染色剂、 25ml 用锡箔纸包好的小瓶、 24 孔板、锡箔纸算好体系，多配。