细菌基因组DNA提取试剂盒(溶液法).doc

细菌基因组DNA提取试剂盒（溶液法）（BacteriaGenomicDNAPreparationKit,solution-basedmethod）PBZ0207-350次280.00PBZ0207-4100次500.00简介本试剂盒用于极大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞基因组DNA的提取亥试剂盒提供的方法简单易行，无需过柱和酚仿抽提简单离心操作便可完成所获的基因组DNA具有完整性好、产量大、纯度高和稳定性好等特点可以满足PCR、酶切等分子生物学实验需要试剂盒组成＜50次＞溶菌酶缓冲液ELB11ml裂解液GDL33ml蛋白沉淀剂PPR12mlRNaseA300卩1缓冲液TE15ml需自备的试剂异丙醇，70％乙醇，溶菌酶试剂盒保存条件及有效期试剂盒保存在室温（15-30C）试剂如出现混浊或结晶，可以将试剂瓶置于55°C水浴加热，溶液变清亮后再使用本试剂盒有效期为12个月RNaseA请置于-20C可保存更长时间操作步骤所有离心步骤皆使用台式离心机，为室温下操作1. 取1ml的细菌培养液（最多提取的细菌数量为2X109个），12,000rpm离心1分钟，弃上清，留细菌沉淀备用2. 提取的细菌为革兰氏阴性菌，直接向菌体沉淀中加入600卩I裂解液GDL。

用吸头吹打几下，充分混匀然后进入步骤43. 3a.提取的细菌为革兰氏阳性菌，必须要进行溶菌酶破壁处理（如不确定为何种菌属，请按处理革兰氏阳性菌的方法进行）具体操作如下：称取10mg溶菌酶，置于1.5ml离心管中，取1ml溶菌酶缓冲液ELB，反复吹打几次将溶菌酶完全溶解，配制成溶菌酶裂解液向细菌沉淀中加入200卩I溶菌酶裂解液（未用完的溶菌酶裂解液可保存于-20C，以备下次使用），吹打重悬细菌沉淀37C破壁处理30分钟以上，一些较难处理的细菌可以延长处理时间破壁处理完成后便可以将水浴温度调至70C备用溶葡萄球菌素对葡萄球菌株破壁非常有效，单是溶菌酶一般不是很好溶菌酶对其它革兰氏阳性菌株非常有效多数情况下，建议首先使用溶菌酶处理，可大大节省费用）3b.12,000rpm离心1分钟，弃上清，向菌体沉淀中加入600卩I裂解液GDL用吸头吹打几下，充分混匀然后进入步骤44. 在70C水浴裂解15-30分钟，期间可以温和颠倒离心管数次以加速裂解5. 离心数秒去除管壁上的水珠，加入5卩1RNaseA，充分混匀，置于37C保温15-60分钟6. 加入200卩I溶液沉淀液PPR，充分振荡混匀，冰水浴5-10分钟，此时可见大量白色沉淀，15,000rpm离心5分钟。

7. 用宽口吸头转移转移上清600卩1到一个已经装有600卩I异丙醇的1.5ml离心管中8. 颠倒离心管缓慢混合数次，室温放置5分钟，一般会看到有丝状DNA出现9. 15,000rpm离心2分钟(将连接离心管的管体和管盖的类似小耳朵的突出部位一致朝向离心机转头的最上边缘，这样离心后，DNA沉淀都在同一侧，洗涤时可防止DNA沉淀被吸头吸掉)10. 小心弃掉上清，注意观察管底的沉淀将管口扣在干净的吸水纸上让管中的液体流尽11. 加入1.0ml70%的乙醇，颠倒离心管3-5次，12,000rpm离心1分钟，倒掉上清12,000rpm离心数秒，用吸头将管底的液体吸尽室温放置5-10分钟12. 待乙醇挥发干净后，加入100卩I缓冲液TE(10mmol/LTrisHCI,1mmol/LEDTApH8.0)充分溶解DNA基因组DNA一般为50kbp以上，溶解DNA需要格外小心70%的乙醇洗涤后，不要干得太久，这样会导致DNA极难溶解不要用吸头反复吹打来加速DNA溶解，这会导致DNA断裂可以在高于室温的水浴(37-65C)中加速溶解，期间可以用食指轻拨管底也可以在室温或4°C长时间缓慢溶解13. 取2-5MDNA进行0.8%琼脂糖电泳检测提取DNA的完整性和质量。