细菌耐药表型的检测方法.ppt

细菌耐药表型的检测方法细菌耐药表型的检测一、β-内酰胺酶的检测 （1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸 片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，10min观察 纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观 察） （2）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、 pH6.8以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液 pH8.5）变为黄色 （3）碘测定法：β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与 破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物 转变成无色 （4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡 中均带有检酶功能二、ESBLS检测 （1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30μg/片） 抑菌圈≤22mm头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm （2）肉汤稀释法：上述药物MIC≥2μg/ml可 疑为ESBLS表型确证试验：对2个任何一 个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸 的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS ） （3）双纸片协同确认试验：头孢他啶（30μg/片）与头孢他啶（30μg）/克位维 酸（10μg）头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg）/克拉维 酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。

4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典AB Biodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销试条中的三代 头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为ESBLS5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊三、Ampc酶检测1.初筛：（1）头孢西汀（30μg/片）与头孢西汀（30μg）/邻氯西林（200μg）后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸如头孢西汀≤18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法）AmpC酶新的检测方法3.三维水相试验方法的改进 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均 匀涂布于M-H平板上 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距 纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待 测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18- 24h。

（3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性 ※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).AmpC酶新的检测方法4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法 操作均匀涂布于M-H平板上 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片 ，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA） （3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上） （4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的 抑菌环为阳性四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平 板上 （2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片 中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸 ，35℃孵育18-24h （3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大 于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β- 内酰胺酶金属β-内酰胺酶的表型检测方法2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。

（2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚 胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性 ，即产金属β-内酰胺酶五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证 （2009年CLSI:M100-S19.APPB.124）1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必要 再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R”的药物 ），但主要以感染控制为目的检验该酶 2.什么是碳青霉烯酶？ 一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如： KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）. • 碳青霉烯类抗生素 －Doripenem（目前无CLSI折点） －厄他培南 －亚胺培南 －美洛培南3.肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点＊亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选因为这些菌属会产生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高 ＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）4.什么时候做改良Hodge试验？ • 如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R” • 注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。

• MIC（μg/ml) 抑菌圈(mm) • 厄他培南 2 19-21 • 亚胺培南＊ 2-4 NA ＊＊ • 美洛培南 2-4 16-21 5.做改良的Hodge试验（确证试验） （1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释 （2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验 一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片 （3）取待测菌（1－3号）从纸片边缘向外划（用1μl接种环 ） （4）35℃培养过夜后，观察结果 （5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生 6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的 表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感性 /特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/特异 性不定（如：低水平的金属酶）。

7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年 CLSI:M100-S19.APPB.124)： 随患者菌株每 天检测 （1）改良Hodge试验阳性菌株: 肺克ATCC BAA-1705 （2） 改良Hodge试验阴性菌株：肺克ATCC BAA-1706六、D-Test试验（1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布 于M-H平板上 （2）在M-H平上板贴一片红霉素 (15ug/片) 纸片， 在距纸片边缘1.5cm处贴克林霉素 (2ug/片) 纸片 （3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹 陷的抑菌环为阳性D-Test试验耐药表型判断耐药机制 红霉素 克林霉素 基因型 ―――――――――――――――――――――――泵出(MS) R S MSRA 核糖体基因诱导变异 (iMls) R D-Test(+) （ ermC为主） 核糖体基因结构变异 (cMLS) R R （ ermA为主） ―――――――――――――――――――――－－七、其它耐药表型检测1.MRSA，MRCNS 2.VRE 3.PRP 4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1附：鉴定卡他球菌方法1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周 围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环 ，即 为阳性。

2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃 公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿色 为阳性。