血清蛋白的分离.ppt

 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成，形成孔径不同的两种胶体不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应本次试验采用不连续电泳系统PAGE，通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分，但两者的原理完全相同，只是所用的电泳槽不同。

由于时间问题，本次试验将分两组进行，一组使用圆盘，一组使用垂直板夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽，电泳仪，直流稳压电源，玻璃板（13×13），注射器及微量注射器抽气泵，干燥器，培养皿，玻璃棒，吸量管，烧杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，滤纸，日光灯制备分离胶、浓缩胶有关试剂： 凝胶缓冲液，分离胶贮存液，0.8%过硫酸铵； 浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮存液，40%蔗糖溶液，核黄素Tris-甘氨酸电极缓冲液（PH8.3）已加入溴酚蓝指示剂的血清样品染色液（氨基黑）1%琼脂（糖）溶液脱色液（7%乙酸溶液）由学生自己配制一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备：（1）安装夹心式电泳槽 将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧 试剂名称试剂名称 用量（用量（ml) 分离胶缓冲液（ph8.9） 2.5ml 分离胶凝胶贮液 5.0ml 蒸馏水 2.5ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空干燥器中 抽气10min过硫酸铵，置于真空干燥器中，抽气10min 10.0ml按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。

迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面，（注意加水时，不要引起胶面的大波动）在室温中放置，当两界面出现不同折射率时表明已凝胶，时间大约40 分钟，以出现折射率不同的界面为准，再室温下放置十分钟，使凝胶充分将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备 试剂名称试剂名称用量（用量（ml) 浓缩胶缓冲液（ph6.7) 0.5ml 浓缩胶贮液 1.0ml 40%蔗糖 2.0ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空干燥器中， 抽气10min 核黄素 0.5ml按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，30~50分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准），凝好后小心拔去加样梳将 Tris—甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板，长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。

用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入约5ul的样品将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极，接通冷却水，开始电泳开始时电流控制在10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至30mA左右当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时，电泳完成将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2 次（注意将正负级的缓冲液分开回收）4.剥胶 将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块玻璃板轻轻剥开，然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中5.固定，染色 在培养皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板，染色分钟左右，此时染色与固定同时进行染色液要回收利用）6.脱色 用 7%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去1.凝胶的制备：（1）安装圆形玻管 将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严，放置在一边等待 灌胶。

 (2) 分离胶制备 按垂直板的方案进行配胶，混匀后迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面，在室温中放置，当两界面出现不同折射率是表明已凝胶，将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备(3) 浓缩胶制备（同垂直板）： 按垂直板的方案进行配制，配制好后，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，30~50 分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准）2.加样将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下槽中（注意需没过玻璃管的上下端），用微量注射器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的样品3.电泳将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极，下槽接直压电泳仪的正极开始时电流控制在1-2mA/管，待样品进入分离胶时，将电流调至5mA 左右/管当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘1-2cm 左右时，停止电泳将缓冲液回收至试剂瓶中（注意正负极分开回收）4.剥胶将玻璃管从电泳槽中取下，用注射器吸满自来水后将针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，使针头在管壁和胶之间前进，胶条在水的压力及润滑的作用下自玻管中脱出，将其放入培养皿中。

5.固定，染色，脱色（同垂直板）由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格地清洗安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过灌胶时，若担心琼脂封底不牢固，则可在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面上面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏浓缩胶凝胶完全聚合后，必须放置30min左右，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后扭曲（凝胶加“老化”整个过程用时大约50分钟）电泳时，电泳仪与电泳槽间正负极不能接错，以免样品反方向泳动电泳后，应分别收集上、下贮槽（正负极）电极缓冲液，切不可混合回收染色液要及时回收垂直板电泳结果：圆盘电泳结果： 谢谢大家！ 祝大家试验成功！！！。