酵母RNA的提取与鉴定.ppt

酵母酵母RNA的提取与鉴定的提取与鉴定 实验目的实验目的 v掌握稀碱法分离酵母掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作的原理与操作过程v了解了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体的组分并掌握定性鉴定的具体方法实验原理实验原理 v由于由于由于由于RNARNA的来源和种类很多，因而提取制备方法的来源和种类很多，因而提取制备方法的来源和种类很多，因而提取制备方法的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有也各异，一般有也各异，一般有也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法苯酚法、去污剂法和盐酸胍法苯酚法、去污剂法和盐酸胍法苯酚法、去污剂法和盐酸胍法Ø苯酚法是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理苯酚法是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理苯酚法是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理苯酚法是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理并离心后，并离心后，并离心后，并离心后，RNARNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，即溶于上层被苯酚饱和的水相中，即溶于上层被苯酚饱和的水相中，即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNADNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，后，后，后，RNARNA即以白色絮状沉淀析出。

即以白色絮状沉淀析出即以白色絮状沉淀析出即以白色絮状沉淀析出Ø此法能较好地除去此法能较好地除去此法能较好地除去此法能较好地除去DNADNA和蛋白质，提取的和蛋白质，提取的和蛋白质，提取的和蛋白质，提取的RNARNA具具具具有生物活性有生物活性有生物活性有生物活性实验原理实验原理 v酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNARNA，含量为，含量为，含量为，含量为干菌体的干菌体的干菌体的干菌体的2.67%~10.0%2.67%~10.0%，而，而，而，而DNADNA含量较少，仅为含量较少，仅为含量较少，仅为含量较少，仅为0.03%~0.516%, 0.03%~0.516%, 为此提取为此提取为此提取为此提取RNARNA多以酵母为原料多以酵母为原料多以酵母为原料多以酵母为原料v工业上制备工业上制备工业上制备工业上制备RNARNA多选用低成本、适于大规模操作多选用低成本、适于大规模操作多选用低成本、适于大规模操作多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法这两种方法所提取的核酸均的稀碱法或浓盐法这两种方法所提取的核酸均的稀碱法或浓盐法。

这两种方法所提取的核酸均的稀碱法或浓盐法这两种方法所提取的核酸均为变性的为变性的为变性的为变性的RNARNA，主要用作制备单核苷酸的原料，，主要用作制备单核苷酸的原料，，主要用作制备单核苷酸的原料，，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单其工艺比较简单其工艺比较简单其工艺比较简单 Ø稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀RNARNA或调或调或调或调pH2.5pH2.5利用等电点沉淀提取利用等电点沉淀提取利用等电点沉淀提取利用等电点沉淀提取的的的的RNARNA有不同程度的降解有不同程度的降解有不同程度的降解有不同程度的降解Ø浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。

变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来实验原理实验原理 vRNARNA含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱/ /嘧啶碱和磷酸各组分嘧啶碱和磷酸各组分嘧啶碱和磷酸各组分嘧啶碱和磷酸各组分RNARNA在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（而转变为糠醛，后者与地衣酚（而转变为糠醛，后者与地衣酚（而转变为糠醛，后者与地衣酚（3 3，，，，5-5-二羟基甲苯）二羟基甲苯）二羟基甲苯）二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂v本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大增大增大增大 RNARNA的溶解度。

当碱被中和后，可用乙醇将的溶解度当碱被中和后，可用乙醇将的溶解度当碱被中和后，可用乙醇将的溶解度当碱被中和后，可用乙醇将RNARNA沉淀，此为沉淀，此为沉淀，此为沉淀，此为 RNARNA的粗品v样品中少量脱氧核糖核酸样品中少量脱氧核糖核酸样品中少量脱氧核糖核酸样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)存在对鉴定无干存在对鉴定无干存在对鉴定无干存在对鉴定无干扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定试剂的配制试剂的配制v地衣酚地衣酚地衣酚地衣酚( (苔黑酚苔黑酚苔黑酚苔黑酚) —) —三氯化铁试剂三氯化铁试剂三氯化铁试剂三氯化铁试剂 将将将将100mg100mg苔黑酚溶于苔黑酚溶于苔黑酚溶于苔黑酚溶于100ml100ml浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加入入入入100mgFeCl100mgFeCl3 3·6H·6H2 2O(O(或等量或等量或等量或等量CuOCuO) )此液需临此液需临此液需临此液需临用时配制用时配制用时配制用时配制 实验步骤实验步骤 1 1、酵母、酵母、酵母、酵母RNARNA的提取的提取的提取的提取 称称称称5g5g干酵母粉于干酵母粉于干酵母粉于干酵母粉于150 ml150 ml三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加50ml 50ml 0.20.2％的％的％的％的 NaOH NaOH，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取30 min30 min。

冷冷却后滴加乙酸使其略偏酸性却后滴加乙酸使其略偏酸性却后滴加乙酸使其略偏酸性却后滴加乙酸使其略偏酸性(pH5~6)(pH5~6) 离心离心离心离心(4000 r(4000 r／／／／minmin，，，，15 min)15 min)，去除沉淀去除沉淀去除沉淀去除沉淀向上清液中加入向上清液中加入向上清液中加入向上清液中加入30 ml 9530 ml 95％乙醇，稍搅拌后静置％乙醇，稍搅拌后静置％乙醇，稍搅拌后静置％乙醇，稍搅拌后静置待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心(4000 r(4000 r／／／／minmin，，，，15 min) 15 min) ，去，去，去，去上清液沉淀加上清液沉淀加上清液沉淀加上清液沉淀加10 ml 9510 ml 95％乙醇，搅拌后再次离％乙醇，搅拌后再次离％乙醇，搅拌后再次离％乙醇，搅拌后再次离心沉淀再依次用心沉淀再依次用心沉淀再依次用心沉淀再依次用10 ml10 ml的无水乙醇、乙醚的无水乙醇、乙醚的无水乙醇、乙醚的无水乙醇、乙醚(×2)(×2)洗涤洗涤洗涤洗涤, , 得得得得RNARNA粗品。

粗品2．．RNA的鉴定的鉴定 取取取取沉沉沉沉淀淀淀淀约约约约0.2 0.2 g g，，，，加加加加2 2 ml ml 1010％％％％HH2 2SOSO4 4→→沸沸沸沸水水水水浴浴浴浴中中中中加加加加热热热热2 2 min→min→加加加加1.5 1.5 mlml地地地地衣衣衣衣酚酚酚酚试试试试剂剂剂剂→→沸沸沸沸水水水水浴浴浴浴中中中中加加加加热热热热→→观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化观察颜色变化实验步骤实验步骤 注意事项注意事项v稀碱法提取的稀碱法提取的稀碱法提取的稀碱法提取的RNARNA为变性为变性为变性为变性RNARNA，可用于，可用于，可用于，可用于RNARNA组组组组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为分鉴定及单核苷酸制备，不能作为分鉴定及单核苷酸制备，不能作为分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNARNA生物活生物活生物活生物活性实验材料性实验材料性实验材料性实验材料v利用等电点控制利用等电点控制利用等电点控制利用等电点控制RNARNA析出时，应严格控制析出时，应严格控制析出时，应严格控制析出时，应严格控制pHpHv地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。

地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应因此地衣酚实验不能作为因此地衣酚实验不能作为因此地衣酚实验不能作为因此地衣酚实验不能作为RNARNA与与与与DNADNA鉴别的依鉴别的依鉴别的依鉴别的依据。