快速分析真菌粗提物中的次级代谢产物-真菌鉴定的新方法.doc

采用LC/TOF-MS快速分析真菌粗提物中的次级代谢产物一真菌鉴定的新方法引言从食品安全的角度考虑需要鉴定从农产品中分离出来的霉菌（真菌），因为它们可能是食品中 霉菌毒素污染的潜在来源鉴定真菌的传统方法以经典的真菌学为基础，包括真菌在不同培养基上 的培养和随后依据形态学和生长行为特征进行的分类然而，这种分类鉴定耗时且带有一定的主观 性，并依赖于真菌学家的经验和技艺此外，这种分类对实际次级代谢产物谱仅能提供参考性证据, 因为这些判断是以前人研究的特定种类真菌的次级代谢为基础这种经验方法由于同种真菌既可能 产生毒素乂可能不产生毒素这一事实的存在而使人更加困惑，也就是说有些真菌容易产生霉菌毒素, 而另外一•些与其无差异的同种真菌从遗传上就不能产生毒素因此，仅靠对真菌物种进行分类不能 真正判断霉菌毒素的产生过去，直接分析真菌培养基以确定是否存在霉菌毒素必然包括“目标”分析，不可避免地假定 能找到那种毒素，而LC/TOF-MS提供了-种可能的新方法用于研究真菌产生毒素的行为即使从基 质中有效提取出的毒素表现出较大的极性差别，TOF-MS的特异性意味着不需要再进行任何样品纯 化而且，也不需要进行日标分析，因为仪器能测定在液相色谱分高中检测到的任何组分分子离子 的精确质量数，这些组分可以通过检索数据库中相关次级代谢产物的精确质量数得以鉴定。

本文介绍从培养真菌中提取次级代谢产物的合适条件和随后进行LC/TOF-MS分析的条件方法 学验证采用在各种培养基中添加黄曲霉毒素、赭曲霉素A、单端泡霉烯、玉米赤霉烯酮和腐马素毒 素，从低浓度基质中提取具有Q好的回收率，随后通过检索比较数据库中465种次级代谢产物进行 鉴定本方法已应用于从培养物收藏单位获得的一,种青霉菌和6种曲霉菌的代谢物鉴定，其次级代 谢产物已与预测的毒素谱进行了比较实验部分所有分析工作均使用Agilent 6210 TOF-MS与Agilent 1200系列HPLC联用完成霉菌毒素和 其它真菌代谢物的分离也采用HPLC系统完成（包括真空脱气机、自动调温进样器、二元泵和DAD 检测器），色谱柱为反相 C18 柱（ZORBAX Eclipse XDB 100 x 2. 1 mm, 1.8 u m） o TOF-MS 配置了 双喷雾器电喷雾源、可以连续导入内标参比标样仪器的扫描范围对所有样品均为m/z 100 ~ 1,000, 扫描速度在9, 429 transicnt/scan下为1 cycle/sec0此质量范围能够涵盖两个内标参比标样产生 的离子,即m/z 121.0508和922.0097。

进样体积5 u LHPLC分析使用的流动相为乙腊和2仙的乙酸铉的1%甲酸水溶液，流速为0.3 mL/mina梯度 洗脱从15%乙腊开始经20分钟增加到100%乙腊色谱柱采用100%乙腊冲洗5 min,每次进样前 平衡5 min.紫外光谱采用二极管阵列检测器获得，每0.4秒从200 run扫描到700 nm,分辨率为4 nm0 TOF-MS的优化条件列于表1采集的数据采用具有精确质量数应用功能的Analyst-QS软件处 理o 465种霉菌毒素和其他真菌代谢产物数据库根据参考文献数据采用Excel创建[1,2],这样创 建的文件容易用于Agilent软件的检索功能参数毛细管电压度雾器压力干燥气干燥气温度碰撞电压锥孔体电压OCT* RFOCT- DC质量范围间/z) 标准质虽表1. LC/MS-TOF在ESI正离子模式下的操作条件3000 V40 psig10 L/min300 C150V60 V250 V37.5 V100-1000121.050873; 922.009798•八极杆真菌提取已鉴定的4 paraciticus (NRRL 299》分曝来自USDA菌种保藏机构，分离菌4 flavus (200198) > A. ochraceus (200700)、A. oryzae (200828)、A. niger (200807)、A. fumigatus (200418)和Q ci tri num (501862)来& TUBITAK Mamara研究中心的菌种保藏部门。

将真菌接种到 分别装有麦芽提取物琼脂(MEA)、马俭薯葡萄糖琼脂(PDA)、和酵母提取物蔗糖琼脂(YES)培养基的陪 替氏培养皿中在25 C下培养7至14天，可以在培养基表而观察到典型的真菌菌落大量繁殖 生长取样采用软木塞钻孔嘴垂直切下两个直径6 nun包含真菌菌丝体和其下培养基的塞状样品将 塞状样品转移至5 n)L的一次性旋盖瓶中提取条件在文献方法［3, 4］的基础上进行改进一个样品 依次采用2 mL含1%甲酸的乙酸乙酯和2 mL异丙醇提取两次;另一个样品依次采用2 mL含1%甲酸 的乙酸乙酯和2 mL乙腊提取两次，随后旋涡混合1 min并进行总计30 min的超声振荡提取物过 滤后用氮气吹干两个样品的残余物溶于1 mL甲醇，超声振荡10 min,经0. 2 nL 一次性过滤器 过滤后用于HPLC分析结果与讨论LC/TOF-MS条件优化最重要的仪器参数，包括毛细管电压、喷雾器压力、干燥气、气体温度和锥孔体电压最初采用 日动调谐达到最大灵敏度然而，碰撞电压也需要优化以提供最多的结构信息，因此常常需要采用 折衷方案本文在不改变其他条件的前提下，通过将碰撞电压由55 V逐步增大到250 V来进行优 化。

确定能够产生裂解的最小碰撞电压为150 Vo整个过程的验证采用20种商品化标物(黄曲霉毒素Bl、B2、G1和G2、黄曲霉毒素Ml、赭曲 霉素A、玉米赤霉烯酮、4-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰 刀菌烯醇、蛇形菌素、镰刀菌酮X、新茄病镰刀菌烯醇、伏马菌素Bl、B2和B3、雪腐镰刀菌烯幅、 HT-2毒素、T-2毒素和曲酸)和内标物(苯甲酮)混合物采用ESI正离子模式，每个成分均得 到质子化分子离子的精确质量数、保留时间和紫外光谱真菌代谢物精确质量数数据库的构建创建一个Excel电子数据表，包含465种霉菌毒素和真菌代谢物中每种成分的精确质量数及相 应的实验分子式［1,2］理论上化合物的单一同位素精确质量数根据其分子式使用Excel电子数据 表（Agilent TOF自带的,称为“分子式数据库生成器”）计算得出并转换成csv （comma-separated values）格式供Agilent TOF数据自动分析软件使用每次样品测定完后LC/TOF-MS仪器自动检索 csv文件并生成报告给出从数据库中检索到的化合物数据分析方法是用数据分析编辑器创建的 编辑器允许选择加合物（例如，与正离子H+,NH4+, Na+等）和中性丢失进行自动检索，也可以进 行质量精度和保留时间限度、报告选项和其它检索与测定标准。

通常不需要保留时间，除非明确其 可增加鉴定的可信度我们使用添加了 20种霉菌毒素混合标物的各种培养基作为样品测定保留时间反复进样10次 以确定这些成分保留时间的重现性鉴定采用的标准需满足如下要求：冲+1离子精确质量数的质量 精度为土 5 ppm；保留时间匹配为土 0.2 min （有标样可用）；最小峰高计数，即化合物的阈值为 1000计数（或信噪比为\0:1,或0.06%相对景）；如果存在预测的成分，则应与预测的加合物和 中性碎片丢失有良好的一致性（在土 5 ppm以内）o方法验证和分析根据上述测定标准，当在培养基中添加25-100 u g/kg浓度的标物时所有20种标物均能正确 鉴定，分析按上述要求进行方法用于测定已鉴定真菌的代谢物上述技术已应用于各种培养基培养的已鉴定真菌代谢物的测定，而非只是简单地通过添加培养 基进行理论上的考察种青霉菌种和6种曲霉菌种在三种不同的培养基上进行培养后，使用上述 简单的溶剂萃取法进行提取,粗提物直接采用LC/TOF-MS进行分析图1所示的是A. flavus提 取物的总离子流色谱图，结果表明检测到大约20种成分在8. 9 min的色谱峰进行数据库检索时 采用测定的精确质量313. 0712。

按M+H离子推算与黄曲霉毒素B1 —•致，与数据库中黄曲霉毒 素B1的精确质量数相比，质量匹配仅差0.2 ppm软件使用分子特征（MFE）算法去掉所有非真实离子峰并将真实离子分组组成“分子特征”这些 分子特征能够根据他们相互间的关系进行鉴定并推导其加合物、二聚体、三聚体及其同位素（表示 为+1、+2等）等将保留时间为8. 9 min的色谱峰鉴定为黄曲霉毒素Bl所依据的分子特征和各离 子测定的精确质量数总结于表2选择一•个分子特征,软件将计算其可能的实验分子式并给出预测 的分子式相应的同位素组成的得分；结果列于表2得分为100的分子式就是黄曲霉毒素B1随后 此分子式被自动转化,采用NIST、Chemlndex和Medline进行网络连接搜索如图2所示,在NIST 中的检索结果给出黄曲霉毒素Bl的分子式和结构TIC of ♦TCf MS 1roo> “fl11 2J35?7TIC of A. flavus3X307sdoSFU*-2.0 072j0e7-1^e7-•1X307mg，020 m30174?g：io as<208103.12 25e.co伐4KQ S5??0 ?1Bg2 IS60 9047。

rirre E，riX1C a • Tor MS OOjOCO 1.313 030 4 (M-nFun^^ODS ,•♦<3 ••< XIS1.Qje68.868(MS40) c610 CO L—L—— —- Lg 8.6 7.0□50 IM 410m/z313.0712CnHiaOs9.068695 e10.J10.5 02011.0Of11 6 OH12 0♦ TOP MS: 8 8P2 e" fwm Fo「的%_305 妇il八t 5ubbjrted(12 3,3 牝 12 91』min)Mfx 7 CT sub.3BC7Qms5脆S(M+H)+3-0*5.8.903 min2)e6313.0712ms，^1.0740ooUL•9529228383Q5siaB10m/x. jhmj7203S33图1. A. flavus提取物的LC/TOF-MS分析图解说明:(a) 总商子流色谱图(TIC).带•峰对应与黄曲霉毒素Bi.(b) 针对黄曲霉毒素Bt的提取离子流色谱图.从m/z 313.058到m/z313.093 :(c) 表明精确质量的全扫描质谙.黄曲尊毒素&的M+1离子质虽误差为0.2叩m。

MFEFeature #27 (RT = Species8.903)RTm/zMassAbundanceWidthM8.903312.063355419330.088M+H8.903313.0706312.063340351860.09M+H+18.903314.07446221470.088M+H+28.902315.0766743490.09M+H+38.906316.079579430.085M+Na8.904335.0529312.0637865800.094。