大肠菌群实验报告.docx

大肠菌群实验报告篇一：大肠杆菌检测实验报告国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数实验目的实验原理：国标法操作的原理实验器材：培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管， 试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布， 脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套， 超净台实验药品：磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH, 5%HCl实验步骤：10 只移液管，1 只 250ml 锥形瓶，5 只大试管，4 个平 皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放 入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min灭完 菌后烘干，完成后放入超净台中用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min1：用电子天平称取成品LB 3. 1241g和琼脂1. 8756g放 入250ml的洁净锥形瓶中2：用量筒量取125ml的蒸馏水 加入该锥形瓶中，制成培养基3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口， 用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下 灭菌20min4：灭完菌后放入超净台中备用1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细 菌溶液。

3：取4只试管，编号1—44：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1 中•震荡试管使菌液均匀6：用1ml无菌移液管从1号试 管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取1ml 细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管 中均加入了细菌溶液9：取4只平皿，编号1—410：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取lml 的菌液置于4只平皿中，加入4 5 — 50摄氏度温度下的培 养基，约15 mm厚度缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合 均匀；待培养基冷凝后倒置11：将培养基在3 6摄氏度条件下培养12小时12：取出培养皿，选择细菌个数在30至300个之间的 平皿数细菌的个数四：实验结果（记得在操作过程和得到结果时拍照）1号， 2号菌落个数多不可计，舍弃4号平皿中菌落数目小于10 cfu ，舍弃3号平皿中菌落分布较均匀，数3号中的菌落数，一共 有210个 cfu 计算样品中细菌浓度为：1.05 X 105 Cfu/ml点评超净台中的实验步骤讲述详细，明确，不错前面的步骤叙述有点乱，建议按照如下标题重新调整顺序。

实验步骤：1、 仪器清洗将烧杯，培养皿、试管等仪器用洗衣粉清洗，超声 5min.然后用清水清洗，超声5min,最后用三蒸水清洗，放入烘箱中烘干2、 培养基配制精确称量放入锥形瓶中，加入mL蒸馏水，摇匀3，灭菌包扎、灭菌，烘干备用3、 超净台中的操作（如上）除了实验步骤和结果，还要有讨论和注意事项 例如：实验讨论：1、 评价该方法（操作简易程度，灵敏度如何，适用性）2、 为何选择细菌个数在 30 至 300 个之间的平皿数细菌的个数？注意事项比如各种仪器的使用注意事项，以及保持洁净，防止染 菌等篇二：大肠杆菌实验报告大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063 阿噟兰1. 前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长 受到抑制但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因 发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状在自然情况下，细 菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条 件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的当给与适当的物 理条件时，其突变率会大大增加如当用a射线、B射线、 Y射线、X射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因 素辐射时，能够促进遗传物质突变DNA对紫外线（UV）有 强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DNA结构变化的形式有DNA链断裂、碱基破坏、 胸腺嘧啶二聚体等因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微 生物菌种选育一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变 率高，诱变最有效的波长253~265 nm选择合适的诱变剂量 对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导 致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需 要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选本实验想要得到 的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为 筛选培养基对菌种进行筛选若菌株没有发生定向突变，则 该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变 才可能在筛选培养基上正常生长紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死 作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常 生长繁殖因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下， 比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析 两者的相关性在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能 了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备2. 材料和方法2.1 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅 拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养 基普通培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10gNacl 5g琼脂20g蒸馏水1000mlPh7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115°C 15min,倒 平板，4 皿* 15m 1*5 组+2 皿* 15ml=22 皿* 15ml=330ml筛选培养基（200ml）：含抗生素50mg/L。

卡那霉素属于 氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的 30S 亚基上的 16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成牛肉膏 5g 蛋白胨 10g Nacl 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml Ph7.0 硫酸卡那霉素水溶液（ 50mg/ml） 0.2ml， 按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115C 15min灭菌, 取出培养基后冷却至60C时将硫酸卡那霉素0・2ml加入培养 基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿* 15ml*5组+2皿* 15ml=12 皿* 15ml=180ml 2.2.2 制备菌悬液（106 ~ 108 个/mL）① 固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基， 37C 培养 24-48h② 菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小 三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌体散开，得到菌悬液③ 菌悬液浓度用血球计数板计数使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数将 菌液滴在血球计数板0・lml的计数格中，细菌被固定染色 后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般 数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌 的数量血球计数板规格：计数格=4*4=16大格 1大格=5*5=25 小格小格体积=0・05*0・05*0・1=0・ 00025mm3=2.5* 10—7ml（长 *宽*高）计算方法例如：125格中90个细菌，则（90 = 125） = （2.5* 10-7）个/ml=2.88* 106所以，125格中的细菌大约在 31（4格1个菌）—3125（每个小格25个菌）个。

2.2.3诱 变处理及接种① 将紫外灯打开，预热30min；② 取无菌培养皿（①90mm，含无菌大针），加入稀释好 的菌悬液8ml以覆盖培养皿底面为宜③ 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上， 开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌1分钟，然后打开皿盖，分别处理10s、20s、40s、 80s、160s （可以累积照射），照射完毕后先盖上皿盖，再关 闭搅拌和紫外灯；④ 每个照射剂量分别取0・5ml分别稀释1000倍和100 倍，然后取稀释液0・1ml做普通培养基的涂布培养，每个处理两个重复；同时每 个照射剂量取0・1ml照射液直接做两个筛选培养基的涂布培 养 ⑤ 对照涂布培养：将照射的菌液稀释 1000倍，在稀 释液中取0・1ml做2个普通培养基涂布培养， 2个筛选培养基的涂布培养涂布要均 匀，培养基表面无液流⑥37°C培养24h后，计数，统计 分析对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化2・2・4・结果计数、分析、统计及讨论① 以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐 标，作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线② 列公式计算不同辐射剂量下的致死率死亡率?照射前活菌数/ml?照射后活菌数/ml?100%照射前活菌数/ml③ 计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率，并分析不同辐射剂量的诱变效果差异原因突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数*100% ④抗药性 菌株的筛选与纯化将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上，与对照菌相比较，观察生长状况3. 结果与分析3.1实验结果记录及初步整理表1.大肠杆菌诱变初始数据照射时间0 10 20 40 80 160筛选培养基活菌数个/皿1号 2号 平均 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0普通培养下 稀释度100 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-2 10-3 10-210-3普通培养基中菌数个/皿1号 2号 平均 5000 XX 366 25 2 2 0 5 40 0 05600 1820 251 64 0 5 0 0 0 0 05300 1820 251 44.5 1 3 0 2.5 20 0 0溶液浓度 个 /ml 5.3* 107 1.8* 106 2.5* 106 4.5* 1041*104 3.5*103 0 2.5*103 2*105 0 03. 2最佳照射时间的设置结合数据处理结果的图和表分析，在10s的照射下，细 菌死亡率达到了 95%, 20s时达到了 99. 9%，说明在20s内大 部分菌株已经死亡，而整个实验过程中未发生任何正突变， 可能与此有较大关系。

已经有实验证实，当菌种死亡率达到 70%~80%时，突变率最大所以在做进一步的实验中应该减 少照射剂量，或通过增多10s内的照射设置，或增大照射距 离，因为时间太短可能导致控制实验的难度加大使死亡率 变化曲线能突显出变化趋势 3.3筛选培养基选择筛选培养基是将发生突变的菌株从普通菌株中显现出 来并对其浓缩该实验中的筛选培养基中的添加剂是硫酸卡 那霉素，若发生突变的菌株能对其显现出抗性，但这抗性也 是有一定范围的，若超过其抗性范围即使发生突变也不能正 常生长本实验选用的50mg/L，实验证明该浓度对于该菌种 抗性选育来说已经过高，应该选择较低的浓度可以在试验 前对该菌种的最低致死浓度做检测将制备好的出发菌株溶 液涂布在含不同浓度硫酸卡那霉素的平板上，37 °C培养24h, 观察不同平板上的菌落数,并记录不同抗生素作用浓度凡 是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度 平板上未长出菌落的,后一浓度即为某种抗生素对出发菌株 的最低致死浓度【1】表2.不同照射剂量下的存活率lg值和死亡率 照射时间 /s 0 10 20 40 80 160存活菌浓度 5.3*107 2.5*106 4.5*104 3.5*103 2.5*103 0存活菌的 lg 值 7.72 6.40 4.65 3.54 3.39死。