第十三章 DNA的生物合成课件.ppt

 生化意义上，基因是为生物活性产生化意义上，基因是为生物活性产物编码的物编码的DNA功能片段功能片段，这些产物主要，这些产物主要是蛋白质或是各种是蛋白质或是各种RNA二二)基因组（基因组（genome) 某一物种拥有的某一物种拥有的全部遗传物质全部遗传物质，即，即全部全部DNA序列序列 (一一)基因（基因（gene）：）：中心法则中心法则 (The Central Dogma)转转 录录翻翻 译译逆转录逆转录复复 制制1958年，年，F.Crick归纳了中心法则归纳了中心法则;1970年，年，H.Temin发现逆转录，补充了中心法则发现逆转录，补充了中心法则RNA复制复制人类基因组计划人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)•1986年年: Dulbecco R , 《癌症研究的转折点《癌症研究的转折点—人类基因组的全序列分析》人类基因组的全序列分析》•1990年年: “人类基因组计划人类基因组计划” 正式启动正式启动 •1999年年:中国正式加入中国正式加入HGP并承担并承担1%的任务的任务•2001年年2月月:人类基因组草图表发表人类基因组草图表发表•2003年年4月月:中、美、日、德、法、英等中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组国科学家宣布人类基因组计划完成计划完成 克隆羊—Dolly19971997年年年年7 7月月月月2424日由日由日由日由WilmeetWilmeet小组克隆成功小组克隆成功小组克隆成功小组克隆成功DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，，Replication 第第 十三十三 章章DNADNA的生物合成包括的生物合成包括的生物合成包括的生物合成包括DNADNA的复制、反转录以及的复制、反转录以及的复制、反转录以及的复制、反转录以及DNADNA损伤修复合成损伤修复合成损伤修复合成损伤修复合成三种不同的类型。

三种不同的类型三种不同的类型三种不同的类型DNADNA复制的概况复制的概况Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板按碱为模板按碱基配对的规律合成子链基配对的规律合成子链DNA的过程发生于细胞分的过程发生于细胞分裂增殖时（裂增殖时（S S期）过程的研究一般采用三类系统：过程的研究一般采用三类系统：1)1)以以 X174 DNA或质粒或质粒DNADNA及其完成复制所必及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统2)2)以以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制为模式生物，研究原核生物的复制3)3)以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的的DNADNA复制复制的分子基础：复制的分子基础：DNA双螺旋结构和碱基配对双螺旋结构和碱基配对 规律规律复制的化学本质：单核苷酸的聚合反应复制的化学本质：单核苷酸的聚合反应复制完成的保证：酶及各种蛋白质因子的参与复制完成的保证：酶及各种蛋白质因子的参与一、一、DNA的半保留复制的半保留复制 DNADNA生生生生物物物物合合合合成成成成时时时时，，，，母母母母链链链链DNADNA解解解解开开开开为为为为两两两两股股股股单单单单链链链链，，，，各各各各自自自自作作作作为为为为模模模模板板板板(template)(template)按按按按碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对规规规规律律律律，，，，合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板互互互互补补补补的的的的子子子子链链链链。

子子子子代代代代细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNA，，，，一一一一股股股股单单单单链链链链从从从从亲亲亲亲代代代代完完完完整整整整地地地地接接接接受受受受过过过过来来来来，，，，另另另另一一一一股股股股单单单单链链链链则则则则完完完完全全全全重重重重新新新新合合合合成成成成两两两两个个个个子子子子细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNA都都都都和和和和亲亲亲亲代代代代DNADNA碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列一一一一致致致致这这这这种种种种复复复复制制制制方式称为半保留复制方式称为半保留复制方式称为半保留复制方式称为半保留复制•半保留复制的概念半保留复制的概念复制复制复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA•子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 DNA半保留复制的证据第一代第二代细菌（含15N-DNA)普通DNA普通DNA重DNA 重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA重DNA普通DNA（（ 14 14NHNH4 4ClCl ））（（ 14 14NHNH4 4ClCl ））按按半半保保留留复复制制方方式式，，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的碱碱基基序序列列一一致致，，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息传信息，体现了遗传的，体现了遗传的保守性保守性。

•半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的复制时，复制时，复制时，复制时，DNADNA从从从从起始点起始点起始点起始点(origin)(origin) 解链，形成解链，形成解链，形成解链，形成复制叉复制叉复制叉复制叉，，，，大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向相反的复制叉相反的复制叉相反的复制叉相反的复制叉二、二、DNA复制的起点和方向复制的起点和方向原核生物复制中的放射自显影图象原核生物复制中的放射自显影图象 复制叉指的是复制叉指的是DNA双链解开分成两股，各自作双链解开分成两股，各自作为模板，子链延模板延长所需要形成的为模板，子链延模板延长所需要形成的Y字行结构字行结构AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C环形环形DNADNA的的θθ型复制型复制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子复制子3’复制子是独立完成复制的功能单位。

复制子是独立完成复制的功能单位 习惯上把两个相邻起始点之间的距离习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个定为一个复制子复制子(replicon) Ø真核生物基因组庞大，有多个染色体真核生物基因组庞大，有多个染色体Ø真核生物每个染色体有多个起始点，是多真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制复制子的复制Ø真核生物有数以万计的复制子，长度差别真核生物有数以万计的复制子，长度差别很大，在很大，在13~900K碱基对之间碱基对之间Ø原核生物是单复制子完成复制，称复制体原核生物是单复制子完成复制，称复制体 真核生物真核生物DNA复制形成复制子的电镜照片复制形成复制子的电镜照片Electron Microscopy of replicating DNA revealsreplicating bubbles. • 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等噬菌体等其感染型的其感染型的DNA为单链，复制时为单链，复制时先形成闭合环状双链先形成闭合环状双链分子（复制型）分子（复制型），随后正链在受核酸内切酶活性的，随后正链在受核酸内切酶活性的protein A蛋白的作用下产生切口。

蛋白的作用下产生切口3’－－OH延伸，保持延伸，保持闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的复闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的复制滚动的同时，外环制滚动的同时，外环5’端逐渐离环向外伸出完成端逐渐离环向外伸出完成一次复制后，一次复制后，protein A把母链和子链切断把母链和子链切断3’端沿母链端沿母链延长，最后合成新的环状延长，最后合成新的环状DNA滚环复制滚环复制形成单链形成单链分子分子n滚环复制的滚环复制的电镜照片电镜照片dNTPDNA-pol γ • 取代环复制（取代环复制（D环复制，环复制，D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，，mtDNA)的复制形式的复制形式特点：复制起始点不在特点：复制起始点不在DNA同一位点，内、外同一位点，内、外环复制有环复制有时序差别，需要引物！时序差别，需要引物！时序差别，需要引物！时序差别，需要引物！ 原核生物原核生物DNADNA的复制的复制第二节第二节•参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP，， 总称总称dNTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子以及以及无机离子无机离子(Mg2+)一、参与原核生物一、参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质（（dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi 复制的化学本质复制的化学本质——单核苷酸的聚单核苷酸的聚合合（（1））DNA聚合酶聚合酶Ø5′至3′的聚合活性（ 5′→ 3′ ），焦磷酸的不断水解推动聚合反应的完成。

pp pp pppPPPOH＋OHOH55γβα＋ PPiN1N2N3N1N2N3′5′33 ′′′3 3 3 3’ ’复制的脱氧核苷酸聚合过程复制的脱氧核苷酸聚合过程•聚合反应的特点聚合反应的特点ØØDNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板；；ØØ遵照碱基互补规律按模板指引合成子链；遵照碱基互补规律按模板指引合成子链；ØØ新链的延长只可沿新链的延长只可沿5  → 3 方向进行方向进行 DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53  的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性Ø核核核核酸酸酸酸外外外外切切切切酶酶酶酶(exonuclease)(exonuclease)是是是是指指指指能能能能从从从从核核核核酸酸酸酸链链链链的的的的末末末末端端端端把把把把核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸依依依依次次次次水水水水解解解解出出出出来来来来的的的的酶酶酶酶，，，，外外外外切切切切酶酶酶酶是是是是有方向性的有方向性的有方向性的。

有方向性的 5´ A G C T T C A G G A T A  3´ | | | | | | | | | | |3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´• 3   5 外切酶活性外切酶活性 • 5   3 外切酶活性外切酶活性?能切除引物及突变的能切除引物及突变的 DNA片段能辨认错配的碱基对，并将其水解能辨认错配的碱基对，并将其水解• 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol ⅠDNA-pol ⅡDNA-pol ⅢArthur Kornberg（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型功能功能：：对复制中的错误进行校读；对复制中的错误进行校读；去除引物去除引物去除引物去除引物；对；对复制和修复中出现的空隙进行填补复制和修复中出现的空隙进行填补DNA-pol Ⅰ（（109kD））二级结构：二级结构：二级结构：二级结构：以以以以α-α-螺旋为主，螺旋为主，螺旋为主，螺旋为主，A~RA~R共共共共1818个个个个α-α-螺旋螺旋螺旋螺旋I~HI~H区区区区，，，，5050个氨基酸残基，个氨基酸残基，个氨基酸残基，个氨基酸残基，覆盖覆盖覆盖覆盖I~OI~O空隙区空隙区空隙区空隙区I~OI~O区区区区，空隙较大，容纳，空隙较大，容纳，空隙较大，容纳，空隙较大，容纳DNADNAA~F 323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5    核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 G~R 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性    5  核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Ⅰ•Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生物学，进行分子生物学研究中常用的工具酶研究中常用的工具酶。

Klenow片段片段DNA-pol ⅡⅡ（（120kD））Ø DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活基因发生突变，细菌依然能存活Ø 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复损伤的应急状态修复 功能：功能：功能：功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶 DNA-pol Ⅲ (250kD)10种亚基组成的不对称二聚体种亚基组成的不对称二聚体α、、ε、、θ组成核心酶组成核心酶，具有，具有53  的聚合活性和的聚合活性和   5  外切活性外切活性ε亚基亚基复制保真所必需复制保真所必需β亚基亚基夹稳夹稳DNA模板，使酶沿模板，使酶沿模板滑动模板滑动γ-复合物（夹子装配复合物）复合物（夹子装配复合物） 促进全酶组装模板上，增强核促进全酶组装模板上，增强核心酶活性心酶活性ØØ2020世纪世纪9090年代末发现的年代末发现的DNA-polDNA-pol IV IV和和DNA-polDNA-pol V V在在DNADNA出现严重损伤时，参出现严重损伤时，参与与DNADNA损伤的修复损伤的修复。

主要成员主要成员 主要作用主要作用解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) 解开解开DNA双链双链SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNA引物引物 拓扑酶拓扑酶 使打结、缠绕、超螺旋的使打结、缠绕、超螺旋的DNA松驰松驰DNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接（（2 2）参与原核生物）参与原核生物DNADNA复制的其他酶和蛋复制的其他酶和蛋白质白质 •引物酶引物酶(primase) ，，DnaG——复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶 在在模模板板的的复复制制起起始始部部位位催催化化NTP的的聚聚合合, 形形成成短短片片段段的的RNA这这一一小小段段RNA作作为为复复制制的的引引物物，，提供提供3 -OH末端，使末端，使DNA-pol能够催化能够催化dNTP聚合。

聚合Ø引物酶与引物酶与RNA聚合酶不同聚合酶不同•编编码码的的基基因因不不同同：：rpoA D, rpoB C编编码码RNA-pol各各亚基；亚基；•对利福平的敏感度不同：对利福平的敏感度不同： RNA-pol敏感敏感DNA连接酶连接酶连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，，从从而而把把两两段段相相邻邻的的DNA链链连连接成一条完整的链接成一条完整的链 • DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式I.I.噬菌体和真核细胞的噬菌体和真核细胞的DNADNA连接酶由连接酶由ATPATP提供能量提供能量II.II.细菌的细菌的DNADNA连接酶由连接酶由NAD+NAD+提供能量提供能量HO5’3’3’5’DNA连接酶连接酶ATP或或NAD+AMP5’3’5’3’lDNA连接酶在复制中起最后接合切口的作用连接酶在复制中起最后接合切口的作用l在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用修复、重组及剪接中也起缝合切口作用l也是基因工程的重要工具酶之一也是基因工程的重要工具酶之一功能功能Dna BDna C解链方向解链方向•解螺旋酶解螺旋酶(helicase)，，Dna B——利用利用ATP供能供能，作用于，作用于氢键氢键，使，使DNA双双链链解开解开成为两条单链成为两条单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 拓扑酶拓扑酶ØDNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解解成单链，它才能起模板作用。

成单链，它才能起模板作用Ø解链过程中，解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变拓扑异构酶，改变DNA分子分子构象，理顺构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行链，使复制能顺利进行拓扑：指物体或图象作弹性移位而保持物体原拓扑：指物体或图象作弹性移位而保持物体原有的性质有的性质超螺旋的电镜照片超螺旋的电镜照片（质粒（质粒DNA））10 8 局部解链后局部解链后解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅰ（（ω-蛋白）蛋白）切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态，从而改变超螺旋变为松弛状态，从而改变超螺旋的圈数反应的圈数反应不需不需ATP可消除和减可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用少负超螺旋，对正超螺旋不起作用主要集中在转录区，与转录有关主要集中在转录区，与转录有关•作用机制作用机制 •拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点•既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅱ（旋转酶）（旋转酶）切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。

在利用口旋转使超螺旋松弛在利用ATP供能扥情况下，连接断端，供能扥情况下，连接断端， DNA分分子进入负超螺旋状态，每作用一次子进入负超螺旋状态，每作用一次可引入可引入2个负超螺旋；在不消耗个负超螺旋；在不消耗ATP的情况下该酶可消除负超螺旋的情况下该酶可消除负超螺旋分布于染色质骨架蛋白和核基质部分布于染色质骨架蛋白和核基质部分，与复制有关分，与复制有关单链单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（single stranded DNA binding protein, SSB) ，， 亦被称为亦被称为 螺旋反稳定螺旋反稳定蛋白蛋白在在E.coli由由177个氨基酸残基组成的四聚体，结个氨基酸残基组成的四聚体，结合单链合单链DNA的跨度约的跨度约32个核苷酸单位，作用时个核苷酸单位，作用时表现为协同作用表现为协同作用作用：作用：维持模板的单链状态；保护单链的完整，维持模板的单链状态；保护单链的完整，防止核酸酶的降解防止核酸酶的降解四种酶催化生成磷酸二酯键的比较四种酶催化生成磷酸二酯键的比较 酶酶 提供提供3′-OH 3′-OH 提供提供5′-P 5′-P 结果结果聚合酶聚合酶 引物和延长中的新链引物和延长中的新链 dNTP dNTP (dNMP)(dNMP)n+1n+1连接酶连接酶 复制中不连续的单链复制中不连续的单链 单链单链 不连续不连续→→连续连续拓扑酶拓扑酶 切断后的链切断后的链 切断后的链切断后的链 改变改变 拓扑状态拓扑状态 引物酶引物酶 NTP NTP NTP NTP 合成引物合成引物 （一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。

解开成单链，提供模板2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端二、大肠杆菌二、大肠杆菌DNA复制的起始复制的起始E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5  3 5 3 1. DNA解链解链解链区解链区解链区解链区20-4020-40个个个个DnaADnaA识别并结合，识别并结合，识别并结合，识别并结合，促使解链区解促使解链区解促使解链区解促使解链区解链链链链。

DnaBDnaB在在在在DnaCDnaC的协同的协同的协同的协同下，解链，下，解链，下，解链，下，解链，置换置换置换置换DnaADnaA识别区识别区识别区识别区20-40个个DnaA蛋白四聚体在蛋白四聚体在ATP参与下与参与下与oriC的的9bp重复序列结合然后重复序列结合然后DnaB蛋白四聚体在蛋白四聚体在DnaC蛋白的参与下和这个区域结合，蛋白的参与下和这个区域结合，DnaB具具有解螺旋酶的活性，使其打开形成两个复制叉有解螺旋酶的活性，使其打开形成两个复制叉引发体引发体DanA 辨认复制起始点辨认复制起始点DnaB 解链解链DnaC 辅助解链辅助解链DnaG 合成引物合成引物DNA模板链复制起始区域模板链复制起始区域引发体（引发体（primosome））含有解螺旋酶含有解螺旋酶DnaB 、、DnaC蛋蛋白、引物酶和白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发复制起始区域的复合结构称为引发体 复制起始：辨认复制起始点，激活引物酶，合成引物复制起始：辨认复制起始点，激活引物酶，合成引物复制起始：辨认复制起始点，激活引物酶，合成引物复制起始：辨认复制起始点，激活引物酶，合成引物。

引发体和引物引发体和引物 Dna A Dna B、、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制复制起始区域的复合结构称为引发体起始区域的复合结构称为引发体 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶II通过切断，旋转，再连接，实通过切断，旋转，再连接，实现现DNA超螺旋转型，在复制整个过程都需要超螺旋转型，在复制整个过程都需要.3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子十几或数分子十几或数十个核苷酸组成，十个核苷酸组成，5’－－3’合成引物引物3' HO5'引物引物酶酶（三）复制的延长（三）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成其化学本质是磷酸二酯键的不断生成  DNA DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链到新链3 3’末端，使其不断延长。

末端，使其不断延长 5’ 3’5’DNA-pol DNA-polDNA-pol DNA-poldATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP复制的半不连续性复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向3´5´3´3´5´领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)现仅发现现仅发现现仅发现现仅发现5’5’－－－－3’3’的的的的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶同一个复制叉中同一个复制叉中同一个复制叉中同一个复制叉中l顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，，复复制制是是连连续续进进行行的的，，这股链称为这股链称为前导链前导链，或，或领头链领头链l另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为后后随随链链，，随随从从链链1968年年，，岡岡崎崎发发现现了了复复制制中中的的不不连连续续片片段段，，称称为为岡岡崎崎片片段段(okazaki fragment，包含，包含RNA引物片段引物片段)。

l领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，，就就是是复复制制的的半不连续性半不连续性 领头链的合成领头链的合成引物引物引物引物随从链的合成随从链的合成冈崎片段长度冈崎片段长度冈崎片段长度冈崎片段长度1000~20001000~2000核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸随从链的模板随从链的模板随从链的模板随从链的模板DNADNA可以折叠或绕成环可以折叠或绕成环可以折叠或绕成环可以折叠或绕成环状，从而保持与领状，从而保持与领状，从而保持与领状，从而保持与领头链的正在延长区头链的正在延长区头链的正在延长区头链的正在延长区域对齐n同一复制叉上领同一复制叉上领头链和随从链由头链和随从链由相同的相同的DNA-pol催化延长催化延长 Figure 8-21*** Trombone model复复制制过过程程简简图图引物酶引物酶引物酶引物酶Ø原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止子在复制的终止子(ter)处汇合oriter E.coli8232 ori terSV40500（四）复制的终止过程：切除引物、填补（四）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空缺、连接切口terG大肠杆菌的顺时针复制叉有4个连续排列的终止子的终止序列；逆时针复制叉有3个连续排列的终止子，当复制叉移动到终止子处，被称作终点利用物质（Tus)的蛋白质会结合在ter序列上，阻止复制叉的移动。

5 5 5 DNA-pol ⅠⅠOHP5 DNA-pol ⅠdNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶• 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接ØDNA复制完成后两个子代分子以连环体的复制完成后两个子代分子以连环体的形式存在，需要由形式存在，需要由TOPO IV将其中的一个将其中的一个环状分子切开，使两个子代分子脱离后再环状分子切开，使两个子代分子脱离后再将其切开的将其切开的DNA连接成环状的分子连接成环状的分子 小小 结结主要成员主要成员 主要作用主要作用DnaA DnaA 识别复制起始位点识别复制起始位点解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) (DnaB) 解开解开DNADNA双链双链SSB SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNADNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPOII TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNADNA松驰松驰DNA-pol Ⅲ DNADNA-pol Ⅲ DNA复制复制DNA-polⅠ DNA-polⅠ 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接终点利用物质（终点利用物质（Tus)Tus) 使复制叉的移动终止在终止子处使复制叉的移动终止在终止子处TOPOIV TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式切开两个子代分子连环体形式第三节第三节 真核生物真核生物DNA的复制的复制 方式方式—— 半保留复制半保留复制(semi－－conservative replication) 复制的高保真性复制的高保真性复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity)(high fidelity) 形式形式———— 双向复制双向复制双向复制双向复制(bidirectional replication)(bidirectional replication) 过程过程———— 半不连续复制半不连续复制半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)(semi-discontinuous replication)真核生物复制的基本过程与原核基本相似真核生物复制的基本过程与原核基本相似Ø真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，，是是多多复复制制子子复复制制。

复复制制有有时时序序性性，，即即复复制制子子以分组方式激活而不是同步起动以分组方式激活而不是同步起动 Ø有有关关真真核核生生物物DNA复复制制的的资资料料主主要要来来源源于于SV40病毒和酵母的研究病毒和酵母的研究（一）常见的真核细胞的（一）常见的真核细胞的DNADNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol  起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性, ,可催化可催化RNARNA链的合成链的合成延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol III)(DNA-pol III)参与低保真度的复制参与低保真度的复制在粒体线粒体DNA复制中起催化作用复制中起催化作用DNA-pol  DNA-pol  DNA-pol  DNA-pol  uu都有都有5 5’－－3 3’核酸外切酶活核酸外切酶活性性 Ø增增 殖殖 细细 胞胞 核核 抗抗 原原 （（ proliferation cell nuclear antigen, PCNA））在复制起始和延长中起关键作用在复制起始和延长中起关键作用ØPCNA为为同同源源三三聚聚体体，，具具有有与与E.coli DNA 聚聚合合酶酶Ⅲ的的β亚亚基基相相同同的的功功能能和和相相似似的的构构象象，，即即形形成成闭闭合合环环形形的的可可滑滑动动DNA夹夹子子，，在在RFC（（相相当当于于γ-复复合合物物））的的作作用用下下PCNA结结合合于于引引物物－－模模板板链链；；并并且且PCNA使使polδ获得持续合成能力。

获得持续合成能力ØPCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标水平也是检验细胞增殖的重要指标Ø在在复复制制叉叉形形成成，， pol α合合成成RNA引引物物及及20nt-30nt的的 DNA生生成成后后，， DNA-pol  / δ通通过过PCNA的的协协同同作作用用，，逐逐步步取取代代pol α，，在在RNA引引物物的的3 -OH基基础础上上合合成成领领头头链链和和随随从链ØØRNA引物由核糖核酸酶H1和翼式核酸内切酶-1（FEN-1)或FEN1/DNase切除，FEN1有切除引物的核酸外切酶活性和内切酶活性缺口由DNA-pol  填补ØØ近些年在真核生物中又发现了近些年在真核生物中又发现了DNA聚合酶聚合酶10多种用于多种用于DNA损伤修复的损伤修复的DNA聚合酶ØØT抗原可解开复制起点处的双螺旋，其功能抗原可解开复制起点处的双螺旋，其功能类似类似DnaB.ØØ蛋白质蛋白质RPA由宿主细胞的基因编码，可结由宿主细胞的基因编码，可结合于单链合于单链DNA，功能类似于原核生物的，功能类似于原核生物的SSBØØ真核也需要拓扑异构酶真核也需要拓扑异构酶II与与DNA连接酶的参连接酶的参与。

与二、真核生物DNA复制的过程Ø（一）（一）SV40DNA的复制的复制 SV40（（simian sarcom avirus40 猴猴肉瘤病毒肉瘤病毒)属乳多空病毒类，是最小的属乳多空病毒类，是最小的DNA病毒之一它可长期潜伏于猴肾细胞，对病毒之一它可长期潜伏于猴肾细胞，对新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种属细胞恶性转化属细胞恶性转化反应主要步骤包括：反应主要步骤包括：Ø1 1））2 2分子分子T T抗原六聚体作为起始蛋白在抗原六聚体作为起始蛋白在ATPATP的存在下与其复制起始区结合并解链的存在下与其复制起始区结合并解链Ø2 2）复制蛋白（）复制蛋白（RPARPA，其作用类似，其作用类似SSBSSB））, ,结结合单链区，进一步提高合单链区，进一步提高T T抗原的解旋酶活性抗原的解旋酶活性但其作用时无协同效应但其作用时无协同效应Ø3 3）） pol αpol α与与T T抗原抗原/RPA/RPA复合物结合，生成复合物结合，生成前导链引物及前导链引物及20nt-30nt20nt-30nt的的 DNADNAØ4 4）复制因子（）复制因子（RFCRFC）先与新合成的）先与新合成的DNA3’DNA3’端结合，端结合，随后随后PCNAPCNA取代取代pol αpol α结合到结合到DNADNA模板上，前导链合模板上，前导链合成暂时中断。

成暂时中断Ø5 5）） DNA-pol DNA-pol  / / δ δ结合到结合到PCNA-RFCPCNA-RFC复合物上，持复合物上，持续准确的合成前导链；同时，续准确的合成前导链；同时， pol αpol α结合到后随结合到后随链的模板上开始其后随链的合成后随链的延伸，链的模板上开始其后随链的合成后随链的延伸，也需要也需要PCNA- DNA-pol PCNA- DNA-pol  / / δ δ取代取代pol αpol αØ6 6））FEN-1-RNase H1FEN-1-RNase H1负责切除引物，负责切除引物，DNADNA连接酶连接酶 I I负责连接片段，拓扑异构酶负责连接片段，拓扑异构酶 I I负责清除正超螺旋，负责清除正超螺旋，拓扑异构酶拓扑异构酶 IIII负责解开连体环负责解开连体环Type II topoisomerases are required to separate daughter DNA moleculesFinishing replication（2）酵母DNA的复制ØØORCORC：起点识别复合物，由：起点识别复合物，由：起点识别复合物，由：起点识别复合物，由6 6个亚基组成，相当个亚基组成，相当个亚基组成，相当个亚基组成，相当于于于于DnaA.DnaA.。

ØØORCORC募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂周期基因周期基因周期基因周期基因cdc6cdc6表达的表达的表达的表达的Cdc6,Cdc6,另一种是另一种是另一种是另一种是Cdc10Cdc10依赖依赖依赖依赖性转录因子性转录因子性转录因子性转录因子1——Cdt1,1——Cdt1,随后募集微染色体维持蛋随后募集微染色体维持蛋随后募集微染色体维持蛋随后募集微染色体维持蛋白白白白2-72-7复合体（复合体（复合体（复合体（Mcm2-7Mcm2-7））））ØØ（（（（Mcm2-7Mcm2-7））））具有解螺旋酶活性，功能相当于具有解螺旋酶活性，功能相当于具有解螺旋酶活性，功能相当于具有解螺旋酶活性，功能相当于DnaBDnaBØØORC- Cdc6- Cdt1- Mcm2-7ORC- Cdc6- Cdt1- Mcm2-7构成前复制复合体构成前复制复合体构成前复制复合体构成前复制复合体pre-RCpre-RCØØCdc6- Cdt1- Mcm2-7Cdc6- Cdt1- Mcm2-7复合物可调控复制的起始，复合物可调控复制的起始，复合物可调控复制的起始，复合物可调控复制的起始，称执照因子或复制许可因子。

称执照因子或复制许可因子称执照因子或复制许可因子称执照因子或复制许可因子Ø细细胞胞能能否否分分裂裂，，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点G1→S及及G2→M的的调调节节，，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性性有有关关蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制pre-RC而而实实施施调调控控作作用用相相关关的的激激酶酶都都有有调调节节亚亚基基即即细细胞胞周周期期蛋蛋白白(cyclin)，，和和催催化化亚亚基基即即细细胞胞周周期期蛋蛋白白依依赖赖激激酶酶(Cdk)和另一种蛋白激酶和另一种蛋白激酶(Ddk) ØCdk和和Ddk可以使可以使pre-RC的的Cdc6、、Cdt1磷磷酸化而失去活性，并脱离酸化而失去活性，并脱离pre-RC，， DNA-DNA-pol pol  / / δ δ在一些辅助蛋白的协助下被募集到在一些辅助蛋白的协助下被募集到pre-RC上，接着募集上，接着募集pol α-pol α-引物酶，从而引物酶，从而确保在合成确保在合成RNARNA引物前，合成前导链和后随引物前，合成前导链和后随链的酶已经到位链的酶已经到位ØCdk可以激活可以激活pre-RC，同时抑制形成新的，同时抑制形成新的pre-RC，从而确保，从而确保DNA在一个细胞周期只在一个细胞周期只合成一次。

合成一次Ø在细胞完成分裂后，在细胞完成分裂后，Cdk即被分解即被分解哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SMØ细细胞胞能能否否分分裂裂，，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点G1→S及及G2→M的的调调节节，，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关 ØØSV40和酵母的复制过程基本相似和酵母的复制过程基本相似ØØ最大的不同是参与两者复制起始阶段的蛋最大的不同是参与两者复制起始阶段的蛋白质因子是不同的，已发现至少有白质因子是不同的，已发现至少有35种基种基因的产物参与真核因的产物参与真核DNA复制的启动复制的启动ØØ在复制的启动阶段，基本步骤及其发生次在复制的启动阶段，基本步骤及其发生次序是相似的，然而，不同的生物在复制起序是相似的，然而，不同的生物在复制起始点的选择，复制起始复合物的组成，和始点的选择，复制起始复合物的组成，和起始蛋白识别的方式方面有明显差异起始蛋白识别的方式方面有明显差异三、真核生物三、真核生物DNA复制的特点复制的特点ØØ（一）原核生物和真核生物（一）原核生物和真核生物DNADNA复制的相同点复制的相同点1 1）半保留复制）半保留复制2 2）半不连续复制）半不连续复制3 3）需要解螺旋酶，并有）需要解螺旋酶，并有SSBSSB或类或类SSBSSB同单链区结同单链区结合。

合4 4）需要拓扑异构酶）需要拓扑异构酶5 5）需要）需要RNARNA引物引物6 6）新链合成有校正机制）新链合成有校正机制Ø（二）原核生物和真核生物（二）原核生物和真核生物DNADNA复制的主要复制的主要差别差别1 1）原核单复制子的复制，真核多复制子的复）原核单复制子的复制，真核多复制子的复制，真核的复制子小制，真核的复制子小2 2）原核的复制叉移动速度）原核的复制叉移动速度900nt900nt，真核的仅，真核的仅为为50nt50nt3 3）原核的冈崎片段）原核的冈崎片段1000-2000nt1000-2000nt，真核的仅，真核的仅为为100-200nt100-200nt4 4）真核的）真核的DNADNA聚合酶和蛋白质因子种类比原聚合酶和蛋白质因子种类比原核细胞多，引物酶活性由聚合酶核细胞多，引物酶活性由聚合酶a a的两个亚的两个亚基承担（引物包含小片段的基承担（引物包含小片段的DNADNA））5 5）原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，）原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制，真就可以在复制起始区启动第二轮复制，真核细胞的复制在有核细胞的复制在有复制许可因子复制许可因子的控制下，的控制下，复制周期不可重叠。

复制周期不可重叠6 6）原核生物的）原核生物的DNADNA为环形分子，为环形分子，DNADNA复制不存复制不存在末端会缩短的问题真核生物在末端会缩短的问题真核生物DNADNA为线性为线性分子，分子，DNADNA复制时末端会缩短，需要复制时末端会缩短，需要端粒酶端粒酶解决线性解决线性DNADNA末端问题末端问题 小小 结结主要成员主要成员 主要作用主要作用DnaA DnaA 识别复制起始位点识别复制起始位点解螺旋酶解螺旋酶(DnaB) (DnaB) 解开解开DNADNA双链双链SSB SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNADNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNARNA引物引物 TOPOII TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNADNA松驰松驰DNA-pol Ⅲ DNADNA-pol Ⅲ DNA复制复制DNA-polⅠ DNA-polⅠ 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接终点利用物质（终点利用物质（Tus)Tus) 使复制叉的移动终止在终止子处使复制叉的移动终止在终止子处TOPOIV TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式切开两个子代分子连环体形式RPARPAØ染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。

呈线状，复制在末端停止Ø复制中岡崎片段的连接，复制子之间的复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接Ø染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙引物，去除后留下空隙三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 •端粒端粒(telomere)指指真核生物真核生物染色体线性染色体线性DNA分子末端（膨大成分子末端（膨大成粒状）的结构粒状）的结构结构特点结构特点• 由染色体末端由染色体末端DNA和蛋白紧密结合和蛋白紧密结合• 其中一条链末端其中一条链末端DNA序列是多次重复的富序列是多次重复的富含含G、、T碱基的短碱基的短 序列，叫序列，叫TG链链;另一条另一条叫叫AC链TTTTGGGGTTTTGGGG…AAAACCCCAAAACCCC…Ø这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构但若端粒缩减到一定程度，细胞的结构但若端粒缩减到一定程度，细胞会停止分裂会停止分裂功能功能• • 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性• • 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性人类染色体端粒人类染色体端粒DNADNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片•端粒酶端粒酶(telomerase)Ø端粒酶端粒酶RNA :有一段序列与端粒有一段序列与端粒TG链突出的链突出的3’末端末端互补。

互补Ø端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白Ø端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶 组成组成RNA--蛋白质复合物蛋白质复合物 端粒酶端粒酶RNA含有与端粒区重复序列含有与端粒区重复序列(TnGn)x相似及互补的序列相似及互补的序列(AnCn)x ，端，端粒酶以自身的粒酶以自身的RNA为模板延长为模板延长DNA单链，单链，然后反折为双链，提供了然后反折为双链，提供了3’-OH与与DNA复制的模板复制的模板——爬行模式爬行模式端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬行模型爬行模型Inchworm model内内在在模模板板RNA逆转录，延长母链逆转录，延长母链DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工端粒与端粒酶是当今的一个研究热点端粒与端粒酶是当今的一个研究热点20092009年度诺贝尔生理学或年度诺贝尔生理学或医学奖揭晓，得主是三位医学奖揭晓，得主是三位美国科学家伊丽莎白－布美国科学家伊丽莎白－布赖克本（赖克本（Elizabeth Elizabeth H.BlackburnH.Blackburn）、卡罗尔－）、卡罗尔－格雷德（格雷德（Carol Carol W.GreiderW.Greider）和杰克－绍斯）和杰克－绍斯塔克（塔克（Jack W.SzostakJack W.Szostak），），他们的研究主题是他们的研究主题是““染色染色体如何受到端粒和端体如何受到端粒和端粒酶的保护粒酶的保护” ” 3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体真核生物复制时的引物不仅包含真核生物复制时的引物不仅包含RNA片断片断还包括一小部分的还包括一小部分的DNA片断。

片断四）（四）DNA复制与核小体组装复制与核小体组装ØØ原核细胞复制速率与生长环境有关原核细胞复制速率与生长环境有关ØØ原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制，调就可以在复制起始区启动第二轮复制，调控机制在控机制在““分子生物学分子生物学””等后续的课程中等后续的课程中学习五）原核生物和真核生物（五）原核生物和真核生物DNA复复制调控的比较制调控的比较ØØ真核生物的真核生物的DNADNA复制调控至少有三个层次：复制调控至少有三个层次：ØØI.I.细胞周期水平细胞周期水平ØØII.II.染色体水平的调控染色体水平的调控ØØIII.III.复制子水平的调控复制子水平的调控逆转录作用逆转录作用Reverse Transcription第四节第四节 逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase，，RT):依赖依赖RNA 的的DNA聚合酶聚合酶兼有逆转录酶活性、兼有逆转录酶活性、RNARNA（水解）酶活性、（水解）酶活性、 DNA DNA聚合酶活性聚合酶活性逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶活性逆转录酶活性DNA-RNA 杂化杂化双链双链RNA（水解）（水解）酶活性酶活性单链单链DNADNADNA聚合酶活性聚合酶活性双链双链DNAØØRTRT没有没有3‘-3‘-外切酶活性，因而缺乏校读功外切酶活性，因而缺乏校读功能，使能，使RNARNA病毒有很高的突变率，这可能是病毒有很高的突变率，这可能是新型病毒频繁出现的一个原因，也是逆转新型病毒频繁出现的一个原因，也是逆转录病毒对许多抗病毒药物产生抗性的主要录病毒对许多抗病毒药物产生抗性的主要原因原因ØØ在逆转录病毒中，逆转录酶以在逆转录病毒中，逆转录酶以tRNAtRNALysLysLysLys为引物起始为引物起始为引物起始为引物起始DNADNADNADNA的的的的合成。

合成逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期RNA衣壳衣壳被膜被膜逆转逆转录酶录酶转录转录转译转译整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞进入细胞丢失被膜丢失被膜丢失衣壳丢失衣壳逆转录逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白衣壳蛋白被膜蛋白被膜蛋白逆转录酶逆转录酶分子生物学研究可应用逆转录分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为重要方法之一，此法称为cDNA法某一细胞的全套某一细胞的全套mRNAmRNA经逆转录经逆转录合成的一整套合成的一整套cDNAcDNA，称，称cDNA文库 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链 试管内合成试管内合成cDNAcDNA  complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ碱水解碱水解 T T T T二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义Ø逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，发展了中心法则。

的重大发现，发展了中心法则 Ø逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能样兼有遗传信息传代与表达功能Ø对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论人类免疫缺陷病毒意到的病毒致癌理论人类免疫缺陷病毒-HIV是爱滋病是爱滋病-AIDS的病原）的病原） DNA损伤与修复损伤与修复DNA Damage and Repair第五节第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为均可称为突变从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基分子上碱基的改变DNA突变具体指个别突变具体指个别dNMP残基以至片断残基以至片断DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为为DNA损伤损伤(DNA damage)突变在生物界普遍存在突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础Ø从从长长远远的的生生物物史史看看，，进进化化过过程程是是突突变变的的不不断断发生所造成的。

发生所造成的Ø大大量量的的突突变变都都是是属属于于这这种种类类型型，，只只是是目目前前还还未未能能认认识识其其发发生生的的真真正正原原因因，，因因而而名名为为自自发发突变或自然突变突变或自然突变(spontaneous mutation)（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性的多态性Ø这这种种突突变变没没有有可可察察觉觉的的表表型型改改变变，，例例如如在在简简并并密密码码子子上上第第三三位位碱碱基基的的改改变变，，蛋蛋白白质质非非功功能能区区段段上上编编码码序序列列的的改改变变等等这这些些现现象象也也相相当普遍Ø多多态态性性(polymorphism)一一词词用用来来描描述述个个体体之之间的基因型差别现象间的基因型差别现象 （三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础一、一、DNA损伤的产生损伤的产生Ø大大量量的的突突变变属属于于自自发发突突变变，，发发生生频频率率只只不不过过在在10-9左左右右但但由由于于生生物物基基因因组组庞庞大大，，细细胞胞繁繁殖殖速速度度快快，，因此它的作用是不可低估的。

因此它的作用是不可低估的Ø实实验验室室用用来来诱诱发发突突变变，，也也是是生生活活环环境境中中导导致致突突变变的因素，主要有物理和化学因素的因素，主要有物理和化学因素 物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, UV)--形成形成TTTT二聚体二聚体 、各种辐射、各种辐射--打断打断DNA分子上的共价键分子上的共价键 UV化学因素化学因素生物因素生物因素肿瘤病毒插入宿主细胞基因组中，引起细胞癌变肿瘤病毒插入宿主细胞基因组中，引起细胞癌变ØDNA分子上的碱基错配称点突变分子上的碱基错配称点突变(point mutation)Ø点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变，点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变，为错意突变为错意突变Ø若不引起氨基酸的替换称同义突变或中性突变若不引起氨基酸的替换称同义突变或中性突变Ø若将氨基酸的密码突变为终止密码，引起肽链合成若将氨基酸的密码突变为终止密码，引起肽链合成的终止，称无义突变的终止，称无义突变Ø碱基置换包括：碱基置换包括： 转换两种嘌呤或两种嘧啶的互换，转换两种嘌呤或两种嘧啶的互换， 颠换嘌呤和嘧啶的互换颠换嘌呤和嘧啶的互换镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基亚基N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)β亚基亚基N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链肽链CTC GAG基因基因缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变序发生改变Ø缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失。

消失Ø插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到DNA大分子中间大分子中间Ø缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致移码突变，或框移突变移码突变，或框移突变 Ø移码移码突变突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变蛋白质氨基酸排列顺序发生改变 3个或个或3n个的个的核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变 谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5’ ……G C A G U A C A U G U C ……丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5’ ……G A G U A C A U G U C ……缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变•端粒端粒(telomere)指指真核生物真核生物染色体线性染色体线性DNA分子末端（膨大成分子末端（膨大成粒状）的结构粒状）的结构结构特点结构特点• 由染色体末端由染色体末端DNA和蛋白紧密结合。

和蛋白紧密结合• 其中一条链末端其中一条链末端DNA序列是多次重复的富序列是多次重复的富含含G、、T碱基的短碱基的短 序列，叫序列，叫TG链链;另一条叫另一条叫AC链TTTTGGGGTTTTGGGG…AAAACCCCAAAACCCC…逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶活性逆转录酶活性DNA-RNA 杂化杂化双链双链RNA（水解）（水解）酶活性酶活性单链单链DNADNADNA聚合酶活性聚合酶活性双链双链DNA物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, UV)--形成形成TTTT二聚体二聚体 、各种辐射、各种辐射--打断打断DNA分子上分子上的共价键的共价键 化学因素化学因素生物因素生物因素缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变序发生改变Ø缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失Ø插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到DNA大分子中间大分子中间Ø缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致移码突变，或框移突变移码突变，或框移突变 。

Ø移码移码突变突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变蛋白质氨基酸排列顺序发生改变 3个或个或3n个的个的核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变 二、二、DNA损伤的修复损伤的修复修复修复(repairing)是对已发生分子改变的是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态补偿措施，使其回复为原有的天然状态Ø直接修复直接修复(direct repair)Ø切除修复切除修复(excision repairing)Ø重组修复重组修复(recombination repairing)ØSOS修复修复 n修复的主要类型：修复的主要类型：光修复酶光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢完全恢复正常光修复酶的激活需光修复酶的激活需300-600 nm波长的光波长的光光修复酶光修复酶(photolyase) UV（一）直接修复系统利用酶简单地逆转（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤损伤UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶ⅠOHPDNA连接酶连接酶ATPnE.coli的切的切除修复机制除修复机制人类典型病症：人类典型病症：着色性干皮病着色性干皮病（（XP）　发病机制）　发病机制与与DNA修复有缺陷修复有缺陷有关。

患者缺乏特有关患者缺乏特异的核酸内切酶，异的核酸内切酶，紫外光照射后易患紫外光照射后易患皮肤癌甲基化指导的错配修复ØØ蛋白质MutS发现错配对位置， MutL和 MutH切除，由Po III和连接酶补齐缺口 （三）重组修复（三）重组修复错误的模板复制的子链带有错误甚至缺口，这种损伤以错误的模板复制的子链带有错误甚至缺口，这种损伤以重组方式修复重组方式修复先复制后修复先复制后修复）由核酸酶和其它重组）由核酸酶和其它重组蛋白将另一股健康链与缺口部分进行交换，以填补缺口蛋白将另一股健康链与缺口部分进行交换，以填补缺口（四）（四）SOS修复修复l当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，，由由此此而而诱诱发发出出一系列复杂的反应一系列复杂的反应l在在E. coli，，各各种种与与修修复复有有关关的的基基因因，，组组成成一一个个称称为为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统的网络式调控系统l这这种种修修复复特特异异性性低低，，对对碱碱基基的的识识别别、、选选择择能能力力差差通通过过SOS修修复复，，复复制制如如能能继继续续，，细细胞胞是是可可存存活活的的然然而而DNA保保留留的的错错误误较较多多，，导导致致较较广广泛泛、、长长期期的的突变。

突变第六节第六节DNA重组和克隆重组和克隆一、一、DNA的重组的重组接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction) 转转 座座 (transposition)1.同源重组同源重组 (homologous recombination)2.位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination) 细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组Ø发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologous recombination)，，又又称称一一般般性性重重组组（（general recombination））是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链链或双链片段的交换或双链片段的交换一）同源重组是最基本的（一）同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式（二）位点特异重组，即特异位点（二）位点特异重组，即特异位点间发生的整合间发生的整合Ø位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。

序列的特异位点间发生的整合免疫球蛋白（免疫球蛋白（Ig）的结构）的结构Ø转座子转座子(transposons) ——可从一个染色可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列体位点转移到另一位点的分散重复序列也就是一段可以发生转座的也就是一段可以发生转座的DNAØ克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合拷贝的集合Ø获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖即无性繁殖一）（一） 克隆的基本概念和克隆的基本概念和PCR二、二、 DNA克隆克隆-DNA Cloning 分子克隆：分子克隆：分子克隆：分子克隆：细胞克隆：细胞克隆：细胞克隆：细胞克隆：动物克隆：动物克隆：动物克隆：动物克隆：克隆的不同层面克隆的不同层面应应用用酶酶学学的的方方法法，，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（（同同源源的的或或异异源源的的、、原原核核的的或或真真核核的的、、天天然然的的或或人人工工的的DNA））与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 ——复复 制制 子子(replicon)，，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，，也也称称基基因因克克隆隆或重组或重组DNA (recombinant DNA) 。

ØDNA克隆克隆Ø生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等Ø 目的：目的：①① 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA ②② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）Ø基因工程基因工程(genetic engineering) —— 用重组用重组DNA技术改变某物种的性状，或得到某基因技术改变某物种的性状，或得到某基因的表达产物，又称重组的表达产物，又称重组DNA工艺学PCRPCR法法PCR--PCR--PCR--PCR--Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction（一）基本工作原理（一）基本工作原理1 1、概念：、概念：聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应-----体外迅体外迅速大量扩增速大量扩增DNA的方法，细胞外的的方法，细胞外的DNA克克隆5 Primer 15  Primer 2Cycle 2Cycle 15 5  5 5  5  5 Template DNA5 5  5 5 5  5  5 5 目目 录录Cycle 35 5  5 5 5  5  5 5 5  5  5 5  5 5 5  5 25～～30 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。

万倍以上目目 录录4 4、、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95˚C延伸延伸72˚C退火退火Tm-5˚C ＜＜1’ 0.5 ~1’1 ~2’ØØ若扩增效率为若扩增效率为100%，，DNA可增加一倍，可增加一倍，若循环若循环30次，则次，则DNA增加增加23030ØØ若扩增效率为若扩增效率为x(小数表示），扩增次数为小数表示），扩增次数为n，得到产物的量为目的基因加入量的，得到产物的量为目的基因加入量的y倍，倍，则可表示为：则可表示为：y=(1+x)n n1、目的基因的克隆、目的基因的克隆2、基因的体外突变、基因的体外突变3、、DNA和和RNA的微量分析的微量分析4、、DNA序列测定序列测定5、基因突变分析、基因突变分析PCR的主要用途的主要用途PCRPCR体系基本成分体系基本成分：n n 模板模板DNA DNA n 特异性引物特异性引物n DNA DNA聚合酶聚合酶 ( (耐热耐热) )n dNTP dNTPn 含有含有MgMg2+2+ （二）基因克隆的基本条件（二）基因克隆的基本条件ØØ合适的工具酶合适的工具酶ØØ合适的载体合适的载体ØØ宿主细胞宿主细胞ØØ合理的技术路线合理的技术路线（（1）工具酶）工具酶Ø 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Ø DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶Ⅰ ⅠØ 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶Ø T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶Ø 碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶Ø 末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶Ø TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5´磷酸基和磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶Ⅰ①①合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接②②缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针③③DNA序列分析序列分析④④填补填补3´末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。

常用于性常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶①①合成合成cDNA②②替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3´羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA的的一一类类内内切切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Ø定义：定义：Bam HⅠ与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNAⅠⅠ、、ⅡⅡ、、ⅢⅢ（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用ⅡⅡ型）型）Ø分类：分类：Ø作用：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。

用罗马数字表示发现的先后次序Ø命名：命名：Hin dⅢ 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶ⅡⅡ类酶识别序列特点类酶识别序列特点—— 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：：平端切口平端切口、、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口HindⅡBam HⅠ来来源源不不同同的的限限制制酶酶，，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Ø同功异源酶：同功异源酶：Bam HⅠBstⅠ有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，，但但切切割割DNA后后，，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，，称称为为同同尾尾酶酶。

这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end) GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G++++ATCTAG GATCT AØ 同尾酶同尾酶Bam Bam HⅠHⅠBg Bg lⅡlⅡ名　　称　　名　　称　　名　　称　　名　　称　　 　　　　识别识别序列及切割位点序列及切割位点序列及切割位点序列及切割位点名　　称　　　　　名　　称　　　　　名　　称　　　　　名　　称　　　　　识别识别序列及切割点序列及切割点序列及切割点序列及切割点切割后切割后切割后切割后产产生５生５生５生５’ ’突出末端突出末端突出末端突出末端: :BamHBamHⅠⅠⅠⅠ 5’…G 5’…G▼GATCC...3’▼GATCC...3’▼GATCC...3’▼GATCC...3’Bgl Bgl ⅡⅡⅡⅡ 5’…A5’…A▼GATCT...3’▼GATCT...3’▼GATCT...3’▼GATCT...3’EcoR ⅠEcoR ⅠEcoR ⅠEcoR Ⅰ 5’…G5’…G▼AATTC...3’▼AATTC...3’▼AATTC...3’▼AATTC...3’Hind ⅢHind ⅢHind ⅢHind Ⅲ 5’…A5’…A▼AGCTT...3’ ▼AGCTT...3’ ▼AGCTT...3’ ▼AGCTT...3’ Hpa ⅡHpa ⅡHpa ⅡHpa Ⅱ 5’…C5’…C▼CGG...3’ ▼CGG...3’ ▼CGG...3’ ▼CGG...3’ Mbo ⅠMbo ⅠMbo ⅠMbo Ⅰ 5’…5’…▼GATC...3’ ▼GATC...3’ ▼GATC...3’ ▼GATC...3’ Nde ⅠNde ⅠNde ⅠNde Ⅰ 5’…GA5’…GA▼TATG...3’▼TATG...3’▼TATG...3’▼TATG...3’切割后切割后切割后切割后产产生生生生3’3’突出末端突出末端突出末端突出末端: :Apa Apa ⅠⅠⅠⅠ 5’…GGGCC5’…GGGCC▼C...3’▼C...3’▼C...3’▼C...3’Hae Hae ⅡⅡⅡⅡ 5’…PuGCGC5’…PuGCGC▼Py...3’▼Py...3’▼Py...3’▼Py...3’Kpn Kpn ⅠⅠⅠⅠ 5’…GGTAC5’…GGTAC▼C...3’▼C...3’▼C...3’▼C...3’Pst Pst ⅠⅠⅠⅠ 5’…CTGCA5’…CTGCA▼G...3’▼G...3’▼G...3’▼G...3’Sph Sph ⅠⅠⅠⅠ 5’…GCATG5’…GCATG▼C...3’▼C...3’▼C...3’▼C...3’切割后切割后切割后切割后产产生平末端生平末端生平末端生平末端: :Alu Alu ⅠⅠⅠⅠ 5’…AG5’…AG▼CT...3’▼CT...3’▼CT...3’▼CT...3’EcoR EcoR ⅤⅤⅤⅤ 5’…GAT5’…GAT▼ATC...3’▼ATC...3’▼ATC...3’▼ATC...3’Hae ⅢHae ⅢHae ⅢHae Ⅲ 5’…GG5’…GG▼CC...3’▼CC...3’▼CC...3’▼CC...3’Pvu ⅡPvu ⅡPvu ⅡPvu Ⅱ 5’…CAG5’…CAG▼CTG...3’▼CTG...3’▼CTG...3’▼CTG...3’Sma ⅠSma ⅠSma ⅠSma Ⅰ 5’…CCC5’…CCC▼GGG...3’▼GGG...3’▼GGG...3’▼GGG...3’ 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（二）基因载体（二）基因载体Ø 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子。

分子Ø 常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNAØ克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为克隆载体设计的载体称为克隆载体Ø表达载体表达载体表达载体表达载体(expression vector) (expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体多肽链而特意设计的载体称为表达载体多肽链而特意设计的载体称为表达载体多肽链而特意设计的载体称为表达载体载体的选择标准载体的选择标准ØØ能自主复制；能自主复制；能自主复制；能自主复制；ØØ容易从寄主细胞内分离纯化容易从寄主细胞内分离纯化容易从寄主细胞内分离纯化容易从寄主细胞内分离纯化ØØ具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；鉴定；鉴定；鉴定；ØØ有克隆位点（外源有克隆位点（外源有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称为多克隆位点；ØØ分子量大小适宜，以容纳较大的外源分子量大小适宜，以容纳较大的外源分子量大小适宜，以容纳较大的外源分子量大小适宜，以容纳较大的外源DNADNA。

ØØ用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子、用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子、用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子、用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子、SDSD序列、终止子等序列、终止子等序列、终止子等序列、终止子等作为载体必须有以下共性：作为载体必须有以下共性：① ① 能在宿主细胞内独立复制能在宿主细胞内独立复制② ② 有供选择的遗传标记，便于检测有供选择的遗传标记，便于检测③ ③ 有多个克隆位点有多个克隆位点 （三）目的基因（三）目的基因 我们所需要的我们所需要的DNADNA序列或基因，就称为目的基序列或基因，就称为目的基因因(target gene)(target gene)或目的或目的DNA (target DNA )DNA (target DNA )目的目的DNADNA有两种类型：有两种类型： 是以是以RNARNA为模板，经反转录合成的与为模板，经反转录合成的与RNARNA互补的单链互补的单链DNADNA 再以再以cDNAcDNA为模板经聚合反应可合成双链为模板经聚合反应可合成双链cDNAcDNA，再逆转录，再逆转录PCRPCR扩增扩增. . n cDNA (complementary DNA)n基因组基因组DNA (genomic DNA) 是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有 DNA DNA序序列，再列，再PCRPCR扩增。

扩增反转录反转录PCRPCR技术技术 (reverse transcription PCR; RT-PCR)(reverse transcription PCR; RT-PCR)　　反转录　　反转录PCRPCR技术是将技术是将RNARNA的反转录反应与的反转录反应与PCRPCR反反应联合应用的一种技术．应联合应用的一种技术．　　首先以　　首先以RNARNA为模板，在反转录酶的作用下合成为模板，在反转录酶的作用下合成cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA为模板通过为模板通过PCRPCR反应扩增目的基因反应扩增目的基因．．Ø受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) Ø导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： （三）基因克隆的基本步骤（三）基因克隆的基本步骤分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 扩扩扩大培养选出的阳性克隆扩大培养选出的阳性克隆  以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程α α互补（蓝白筛选）互补（蓝白筛选）（四）基因克隆的应用领域ØØ基因组学的研究：需将染色体分解成长的基因组学的研究：需将染色体分解成长的DNA片段，克隆到细菌人工染色体等载体片段，克隆到细菌人工染色体等载体中，构成重叠群，才能用于进一步的测序。

中，构成重叠群，才能用于进一步的测序ØØ蛋白质组学蛋白质组学ØØ生物制药：生物制药：利用基因工程生产有药用价值利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产世纪的支柱产业 ØØ转基因植物，转基因动物转基因植物，转基因动物1 1、、掌掌握握半半保保留留复复制制，，半半不不连连续续复复制制的的相相关关概概念念;DNA;DNA聚聚合合酶酶（（真真核核，，原原核核））及及其其反反应应特特点点; ; 掌掌握握DNADNA突突变变的的相相关关概概念念、、损损伤伤的的修修复复方方式式；；限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶、、重重组组DNADNA技技术术基基本操作步骤；聚合酶链反应的基本原理本操作步骤；聚合酶链反应的基本原理2 2、、熟熟悉悉解解链链酶酶，，拓拓扑扑异异构构酶酶 ，，引引物物酶酶及及DNA DNA 连连接接酶酶催催化化的的反反应应，，同同源源重重组组，，cDNAcDNA文文库概念目的与要求目的与要求复习思考题•1、、DNA复制时不需要下列哪一种酶？复制时不需要下列哪一种酶？•A DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶 •B RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶•C DNA指导的指导的RNA聚合酶聚合酶•D 连接酶连接酶•E 拓扑异构酶拓扑异构酶 •2 下列过程中不需要下列过程中不需要DNA连接酶参与的是连接酶参与的是•A DNA 复制复制 B DNA重组重组•C DNA 修复修复 D DNA修饰修饰(C)(D)•3 DNA 复制时，如模板链为复制时，如模板链为 5′-TAGA-3′将会合将会合成哪种互补结构？成哪种互补结构？•A 5′-TCTA-3′ B 5′-ATCT-3′•C 5′-UCUA-3′ D 5′-AUCU-3′•4 名词解释名词解释半保留复制半保留复制 领头链领头链 随从链随从链 冈崎片段冈崎片段 点突变点突变同同同同源重组源重组 DNA克隆克隆 聚合酶链反应聚合酶链反应 cDNA文库文库(A)5.参与参与DNA复制的主要酶类和蛋白质有哪复制的主要酶类和蛋白质有哪些？个有何主要功能？些？个有何主要功能？6.DNA高保真性主要取决于哪些因素？高保真性主要取决于哪些因素？7.何为反转录？在哪些情况发生反转录？主何为反转录？在哪些情况发生反转录？主要的酶促反应过程是怎样的？要的酶促反应过程是怎样的？8.本章中催化磷酸二酯键生成的酶有哪些？本章中催化磷酸二酯键生成的酶有哪些？试比较他们的不同特点。

试比较他们的不同特点。