测蛋白质含量方法.doc

蛋白质含量测量方法从查阅的资料来看， 目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、 双缩脲 法 (Biuret) 、紫外吸收法、考马斯亮蓝法( Bradford )、Folin 酚试剂法这五 种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点， 在选择方法时应考虑： ⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ⑵蛋白质的性质； ⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间凯氏定氮法1、实验原理蛋白质是含氮的有机化合物食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐 酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量1) 有机物中的胺根在强热和 CuS04浓H2SO4作用下，硝化生成(NH4 2SO4反应式为：CuS04 +2NH2 — +H2S04+2H+= (NH4)2S042)在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中反应式为 :(NH4)2SO4+2NaOH = 2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O(3)用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据 HCI消耗的量计算出氮的含量, 然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量 反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O = (NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCI+5H2O = 2NH4C1+4H3BO32、操作方法( 1 )样品处理：精密称取 0.2-2.0g 固体样品或 2-5g 半固体样品或吸取 10-20mI 液 体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜， 6g 硫酸钾及 20 毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45 度角斜支于有小孔 的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内 液体微沸， 至液体呈蓝绿色澄清透明后， 再继续加热 0.5 小时。

取下放冷， 小心加 20ml 水，放冷后，移入 100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水 至刻度，混匀备用 取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、 浓硫酸同一方法做试剂空 白试验2)按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3 处加甲基红指示剂数滴及数用调压器控制，加热煮沸水蒸1 滴，并使冷凝管的下端插入 并以 10ml 水洗涤小烧杯使流毫升硫酸， 以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸， 气发生瓶内的水 3)向接收瓶内加入 10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂 液面下， 吸取 10.0ml 样品消化液由小玻璃杯流入反应室，入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞将 10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室， 立即将玻璃盖塞紧， 并加水于小玻璃杯以防漏气 夹 紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏 5min 移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏 1mi n,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部取下接收瓶，以 0.01N 硫酸或 0.01N 盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点 同 时吸取 10.0ml 试剂空白消化液按（ 3）操作。

3、优点缺点凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确 , 重现性好,但操作复杂费时 ,试剂消耗量大二、 双缩脲法 （Biuret）1、实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3是两个分子脲经180 C左右加热,放出一个分子氨后得到 的产物在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应 凡具有两 个酰胺基或两个直接连接的肽键 , 或能够以一个中间碳原子相连的肽键 , 这类化合物都 有双缩脲反应紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 , 而与蛋白质分子量及氨基 酸成分无关 , 故可用来测定蛋白质含量2、操作方法（ 1 ）标准曲线的测定：取 12支试管分两组,分别加入 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 毫升的标准蛋白质溶液, 用水补足到 1 毫升, 然后加入 4毫升双缩脲试剂 充分摇匀后, 在室温（20~25C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定用未加蛋白质溶液的第 一支试管作为空白对照液取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值 为纵座标绘制标准曲线2）样品的测定：取 2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度 注意样品浓度不要超过 10mg/ml。

3、优点缺点实验操作简便迅速，但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1〜20mgPmL时测定结果 较准确双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定三、 紫外吸收法1、 实验原理蛋白质分子中 , 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键 , 使蛋白质具有 吸收紫外光的性质 , 吸收峰在 280nm 处, 其吸光度 （即光密度值 ） 与蛋白质含量成正比 此外 , 蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比 利用一定波长下 , 蛋白质溶液 的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系 ,可以进行蛋白质含量的测定2、 操作方法取待测样品制成蛋白浓度大约在 0. 1 〜1. 0mgPmL 的蛋白质溶液 ,用紫外分光光度 计进行比色 , 对照标准曲线得出样品含氮量每个样品做 3 次重复测定 , 取平均值3、优点缺点紫外吸收法简便、灵敏、快速 , 不消耗样品 , 测定后仍能回收使用此法测定蛋白质 含量的准确度较差 ,干扰物质较多 , 在用标准曲线法测定蛋白质含量时 ,对那些与标准蛋 白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差 , 故本法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质 会出现较大的干扰 核酸的干扰可以通过查校正表 , 再进行计算的方法加以适当的校正 但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的 ,虽然经过校正 , 测定的结果还是 存在一定的误差四、考马斯亮蓝法（ Bradford ）1、实验原理Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的考马斯亮蓝是一种有机染 料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和 芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从 465 nm 变为 595 nm, 蛋白质在 1〜1 000卩g范围内,蛋白质—色素结合物在 595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成 正比 ,故可用于蛋白质的定量测定2、操作方法（1） 标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入 1.0ml 蒸馏水做空白， 5只分别加入不同体积的浓 度为 100ug/ml 牛血清清蛋白标准液，补充水到 1.0ml 然后每只试管加入 5.0ml 考马 斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置 5min，在紫外-可见分光光度计 595nm处测定吸光值以 A595 吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的 ug 数量为横坐标绘制标准曲线。

具体操作见下 表蛋白质标准曲线测定加样试剂 空白 1 2 3 4 5100ug/ml 牛血清清蛋白 /ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8牛血清清蛋白 /ug 0 10 20 40 60 80去离子水 /ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝 G-250 试剂 /ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0吸光值 A595（2） 蛋白样品配制浓度约 100ug/ml 的待测蛋白质溶液 取一只试管加入 1.0ml 蒸馏水做空 白， 一支加入 0.5ml 待测蛋白质溶液，补充水到 1.0ml 然后每支试管加入 5.0ml 考马斯亮 蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值用测 得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的 ug 数量，计算出待测蛋白质的含 量 在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做 3支平行管3） 试剂配置a. 牛血清清蛋白标准液 结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定 该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是 6.6 来计算其百分含量。

然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为 100 ug/ml 的蛋白溶液b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸， 作为母液保存，使用时用水稀释到 1000ml试剂的最终浓度为 0.01%考马斯亮蓝G-250、 质量浓度为 0.085g/ml 磷酸3、优点缺点该法方法简便 , 易于操作 ,所用试剂较少 ,显色剂易于配制干扰物质少 , 如糖、缓 冲液、 还原剂和络合剂等均不影响显色 此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同 , 因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差 , 在制 作标准曲线时通常选用 y-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差五、 Folin 酚试剂法1、实验原理Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成 的第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为 Folin- 酚试剂 （ 磷钨酸和磷钼酸混合液 ） 因此，反应的程序也是分两步进行的第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质 中的肽键与Cu2+乍用生成络合物； 第二步是基于 Folin 试剂 （磷钼酸和磷钨酸试剂 ） 在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 （ 呈蓝色反应 ） 。

由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸， 故有此呈色反应 而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比关系此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量本法可测定范围是25—250g2、操作方法（1） 标准曲线的测定取 16支大试管， 1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入 0，0.1 , 0.2 , 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250mg/ml）用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入 5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（ 20〜25C）放置10分钟再逐管加入 0.5毫升试剂乙（Folin —酚试剂），同样立即混匀这 一步混合速度要快， 否则会使显色程度减弱 然后在室温下放置 30分钟， 以未加蛋白质 溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm处测定各管中溶液的吸光度值以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深， 因此各项操作必须精确控制时间， 即第1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第 2支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3支试管， 余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过 10分钟， 则第 1支试 管可立即加入 0.5 毫升试剂乙， 1 分钟后第 2支试管加入 0.5 毫升试剂乙， 2分钟后加第 3 支试管，余此类推待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸 收每分钟测一个样品进行多试管操作时， 为了防止出错， 必须在实验记录本上预先画好下面的表格 表中 是每个试管要加入的量（毫升） ，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入最下面两 排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值 2） 样品的测定取1毫升样品溶液 （其中约含蛋白质 20~250微克） ，按上述方法进行操。