微生物学课件：第2章 纯培养和显微技术.ppt

第2章 纯培养和显微纯培养和显微技术技术Content•Basic laboratory techniques for cultivation of microbiology•Basic laboratory techniques for microscopic examination微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！t 在绝大多数情况下都是利用在绝大多数情况下都是利用微生物的群体微生物的群体来研究其属性；来研究其属性；t 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术培养技术在微生物学中具有重要意义！在微生物学中具有重要意义！参见参见P13P13在研究中所使用的微生物培养群体：在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：混合培养物：含有多种微生物的培养物；含有多种微生物的培养物；纯培养物：纯培养物： 只有一种微生物的培养物；只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！纯培养技术是进行微生物学研究的基础！参见参见P13P13 微生物个体微小的特点也决定了微生物个体微小的特点也决定了显微技术显微技术是进行微生物研究是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。

通过显微镜才能进行观察和研究 （（P12P12第一段第一段））微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！参见参见P13P13第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术各种显微镜的基本原理及其样品制备方法各种显微镜的基本原理及其样品制备方法第一节第一节 微生物的分离和纯培养微生物的分离和纯培养 从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步是研究和利用微生物的第一步一、无菌技术一、无菌技术t 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；t 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身其自身也不污染环境；也不污染环境； （（P14P14第第1 1段）段）（参见（参见P13P13、、1414））一、无菌技术一、无菌技术参见参见P14P14一、无菌技术一、无菌技术参见参见P14P141 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具：试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等18871887年，年，R J Petri R J Petri 发明发明 Petri dish参见参见P14P14装有培养基后称为装有培养基后称为“培养平板培养平板” Or “平板平板”(plate)(具体灭菌方法第具体灭菌方法第6章介绍章介绍)高温干热灭菌高温干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：常用的灭菌方法：1 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具：参见P142 2、接种操作、接种操作无菌操作：无菌操作： 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行参见参见P15P15二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基：培养基：液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半固体培养基；参见参见P15P15二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基：培养基：液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半固体培养基；固化剂固化剂柯赫（柯赫（Robert KochRobert Koch））的助手的助手W HeeseW Heese和和他他的夫人的夫人Fran HeeseFran Heese参见参见P15琼脂琼脂二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养菌落（菌落（colonycolony）：）： 单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的有一定形态结构的子细胞生长群体。

子细胞生长群体 （（P15P15，，倒数第倒数第2 2段）段）众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawnlawn））不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（（形状、颜色等形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（（见见P15P15，，倒数第二段；图倒数第二段；图2-32-3）斜面培养基上细菌菌苔特征 液体培养基中细菌生长特征 二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！稀释！参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养1 1、稀释倒平板法、稀释倒平板法2 2、涂布平板法、涂布平板法操作较麻烦，对操作较麻烦，对好氧菌、热敏感好氧菌、热敏感菌效果不好！菌效果不好！使用较多的常规使用较多的常规方法，但有时涂方法，但有时涂布不均匀！布不均匀！参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养3 3、平板划线法、平板划线法参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养3 3、平板划线法、平板划线法参见P163 3、平板划线法、平板划线法参见参见P16P16二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱参见参见P17P17二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱参见参见P17P17二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离稀释摇管法稀释摇管法参见参见P16P16三、用液体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养0.0480.0480.048 + 0.0012 + 0.00020.048 + 0.0012 + 0.0002= 0.9750.975 稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过平行试管中，大多数（一般应超过95%95%）表现为不生长。

表现为不生长例如：若同一稀释度的试管中有例如：若同一稀释度的试管中有95%95%表现为不生长，则表现为不生长，则生长的试管中仅生长的试管中仅含一个细胞的几率为：含一个细胞的几率为：4.8%4.8%；； 含二个细胞的几率为：含二个细胞的几率为：0.12%0.12%；； 含三个细胞的几率为：含三个细胞的几率为：0.002%0.002%在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%97.5%参见参见P17P17四、单细胞（孢子）分离四、单细胞（孢子）分离t 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；t 操作难度与细胞或个体的大小成反比；操作难度与细胞或个体的大小成反比；参见参见P17P17～～1818通过通过机械机械、、空气空气或或油压油压传动装置来减小手的动作幅度，传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用在显微镜下用毛细管毛细管或显微或显微针针、、钩钩、、环环等挑取单个等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。

微生物细胞或孢子以获得纯培养 利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得某一个生态环境某一个生态环境（例如（例如1 1克土壤）克土壤）中所有种类细菌中所有种类细菌的纯培养？的纯培养？假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长Ø 同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌； Ø 不同细菌在数量存在差异；不同细菌在数量存在差异；微生物在自然条件下存在的特点：微生物在自然条件下存在的特点：五、选择培养分离五、选择培养分离t 抑制大多数其它微生物的生长；抑制大多数其它微生物的生长；t 使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化方便用稀释法对其进行纯化微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化： 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的 （（ P18 P18 第第2 2大段）大段）t 使待分离的微生物生长使待分离的微生物生长““突出突出””；；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离1. 1. 利用选择培养法进行直接分离利用选择培养法进行直接分离 待分离的微生物生长，待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制其它微生物的生长被抑制t 高温下培养：分离嗜热细菌；高温下培养：分离嗜热细菌；t 培养基中不含培养基中不含N N：：分离固氮菌；分离固氮菌；t 培养基加抗生素培养基加抗生素：：分离抗性菌；分离抗性菌；参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离1. 1. 利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离 待分离的微生物待分离的微生物的生长特征明显不同的生长特征明显不同于其它微生物于其它微生物t 牛奶平板牛奶平板：：分离蛋白酶产生菌；分离蛋白酶产生菌；参见参见P18P18五、选择培养分离五、选择培养分离2. 2. 富集培养富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加参见参见P18P182. 2. 富集培养富集培养 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。

营养和生理条件的几乎无穷尽的富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要 （（ P 19P 19，第二段），第二段）根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；分离培养在特定环境中能生长的微生物；参见参见P18P18七、微生物的保藏技术七、微生物的保藏技术（移到第八章（移到第八章 微生物遗传）微生物遗传） 微生物个体微小的特点也决定了微生物个体微小的特点也决定了显微技术显微技术是进行微生物研究是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态个体形态及其及其内部结构内部结构只能只能通过显微镜才能进行观察和研究通过显微镜才能进行观察和研究 （（P12P12第一段第一段））微生物的基本特点：微生物的基本特点：小！参见参见P13P13第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术几个基本概念：几个基本概念：放大放大 分辨率分辨率 反差反差被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！特定条件下能辨析的两点之间的最小距离特定条件下能辨析的两点之间的最小距离被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。

的标本制作和观察技术，这就是显微技术 P21 P21 倒数第一段倒数第一段参参见见 P P 2 21 1100%200%800%一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术－－构造－－构造分为三部分：1、光学放大系统：目镜、物镜2、照明系统：光源、聚光镜、各种滤光片3、机械系统：镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒和调节螺旋等 一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？目镜：目镜：10 ~ 15 ××；物镜：；物镜： 100 ×；总放大倍数；总放大倍数1000~1500 ×；；使用油镜，即在使用油镜，即在100100×物镜和载玻片之间滴加香柏油；物镜和载玻片之间滴加香柏油；参见参见P 22P 22评价显微镜性能参数－分辨率（D）•显微镜能够辨别两个质点间最小距离的能力。

λ 表示波表示波长N 表示标本和物镜之间介质折射率；α 表示镜口角；N·sin(α/2)即为数值孔径NA 物镜的镜口角物镜的镜口角 介质为空气时，N＝1，α最大值可达140°，最短的可见波长λ＝450 nm，分辨率D＝292 nm，约0.3 µm使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N＝1.515）或液体石蜡（N =1.52），分辨率可达0.2 µm所以普通光学显微镜的最大分辨率是0.2 µm1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜q q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离低倍镜的分辨率低于高倍镜低倍镜的分辨率低于高倍镜参见参见P 22P 22用浸没油取代空气的作用：用浸没油取代空气的作用：介质折射率提高介质折射率提高分辨率得到提高分辨率得到提高参见参见P 22 P 22 第第2 2大段大段光线在穿过折射率不同的介质时发生折射光线在穿过折射率不同的介质时发生折射改变光折射角度改变光折射角度增加照明亮度增加照明亮度很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高照明亮度提高，，改善观察效果改善观察效果。

P22 P22 第第2 2大段）大段）浸没油与玻璃的折射率相近浸没油与玻璃的折射率相近光学显微镜物镜的特性光学显微镜物镜的特性人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 0.2 mmmm左右，因此光学显微镜的最大左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是有效放大倍数（使用油镜）是1,0001,000××到到1,5001,500××参见参见P 22P 22相差显微镜相差显微镜－原理－原理p 光线通过未经染色的标本如活细胞时，由于细胞各组分密度光线通过未经染色的标本如活细胞时，由于细胞各组分密度的差异和折射率的不同，直射光和衍射光的光程就会有差别，的差异和折射率的不同，直射光和衍射光的光程就会有差别，光波的相位发生改变，产生光波的相位发生改变，产生相位差相位差p人的肉眼分辨不出光的相位差异，只能分辨光的人的肉眼分辨不出光的相位差异，只能分辨光的波长（颜色）波长（颜色）和振幅的差异（明暗差异）和振幅的差异（明暗差异）因此，活细胞在普通光学显微因此，活细胞在普通光学显微镜下观察时，所看到的整个视野的亮度是均匀的但相差显镜下观察时，所看到的整个视野的亮度是均匀的但相差显微镜可将这种光程差或相位差转换成振幅差。

微镜可将这种光程差或相位差转换成振幅差p相差显微镜的基本原理相差显微镜的基本原理是把透过标本的可见光的是把透过标本的可见光的光程差变成光程差变成振幅差振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，清晰可见光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程，则光程差变为差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别反差，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别p相差显微镜可使人们能在不染色情况下清楚地观察到普通光相差显微镜可使人们能在不染色情况下清楚地观察到普通光学显微镜下看不到或看不清的活细胞以及细胞内的某些细微学显微镜下看不到或看不清的活细胞以及细胞内的某些细微结构相差显微镜光路图 ①环形光阑：位于光源与聚光器之间，其上有一透明的亮环，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上后产生两部分光，一部分是直射光，另一部分是经过标本后产生的衍射光。

②相位板：可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ相位板分为两种： A 相板 将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本是明亮的而背景是暗的，形成亮反差，称为明相差或负相差；B 相板 将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本是暗的而背景是亮的，形成暗反差，称为暗相差或正相差③合轴调节望远镜： 用以调节环状光阑和相位板环的重合④绿色滤光片： 由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常用绿色滤光片来调解光源的波长 相差显微镜具有四个特殊结构：相差显微镜具有四个特殊结构：1、环状光阑、环状光阑2、相位板、相位板3、合轴调节望远镜、合轴调节望远镜4、绿色滤光片绿色滤光片一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理3. 3. 相差显微镜相差显微镜形成亮背景暗物象的结果形成亮背景暗物象的结果（相消干涉）（相消干涉）参见参见P 23 P 23 第第2 2大段大段一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理3. 相差显微镜相差显微镜A 相长干涉相长干涉 B 相消干涉相消干涉（（M＋＋M’为干涉光束的合成波）为干涉光束的合成波）一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理5. 5. 透射电子显微镜；透射电子显微镜；6. 6. 扫描电子显微镜扫描电子显微镜分辨率与所用分辨率与所用波长成反比！波长成反比！参见参见P 24P 24电子束电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像聚集成像。

而一束电而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短在理论上，电子波的波长最短可达到在理论上，电子波的波长最短可达到0.005 nm0.005 nm，所以电子显微镜的，所以电子显微镜的分辨能分辨能力力要远要远高于光学显微镜高于光学显微镜 （（P24P24第第2 2大段）大段）电镜的分辨本领和有效放大倍数•人眼分辨率：0.2mm•普通光学显微镜分辨率：0.2μ, 放大倍数：0.2mm/0.2 μ=1,000倍•电镜分辨率：0.2nm 放大倍数：0.2mm/0.2 nm=1,000,000倍 ----有效放大倍数 但电镜分辨率受制样技术技术限制一般在超薄切片样品中，其分辨率为超薄切片厚度的1/10例如如果切片厚度50nm则分辨率为5nm，大大低于0.2nm分辨率。

•电镜分辨本领：电镜处于最佳状态下的分辨率电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造1、电子束照明系统：电子枪、聚光镜；2、成像系统：物镜、中间镜、投影镜；3、真空系统：4、记录系统图图3-11 3-11 电子显微镜构造和光成像原理电子显微镜构造和光成像原理1、电子束照明系统：电子枪、聚光镜；2、成像系统：物镜、中间镜、投影镜；3、真空系统：4、记录系统电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较主要电镜制样技术主要电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备用于电镜观察的样本制备示意图示意图 负染色技术负染色技术（（Negative staining）与）与金属投影金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（Freeze etching）） （（技术示意图技术示意图）） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构和膜表面结构 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技术（（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching））电镜三维重构技术电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。

具有重要应用前景的一门新技术电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（（Structural BiologyStructural Biology）） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段 主要电镜制样技术主要电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备用于电镜观察的样本制备示意图示意图 负染色技术负染色技术（（Negative staining）） 染色背景，衬托出样品的精细结构染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（Freeze etching）） （（技术示意图技术示意图）） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构和膜表面结构 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技术（（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching））电镜三维重构技术电镜三维重构技术(自学）自学）电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。

具有重要应用前景的一门新技术电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（（Structural BiologyStructural Biology）） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段 超薄切片技术•电子束穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般为40～50nm－－超薄切片；•超薄切片制作主要步骤：图图3-12 3-12 电镜超薄切片样本制备示意图电镜超薄切片样本制备示意图锇酸戊二醛高锰酸钾环氧树脂40～50nm脂质：锇酸脂质：锇酸蛋白质：铅盐蛋白质：铅盐核酸：醋酸铀核酸：醋酸铀扫描电镜扫描电镜原理与应用原理与应用：：电电子子“探探针针”扫扫描描，，激激发发样样品品表表面面放放出出二二次次电电子子，，探测器收集二次电子成象探测器收集二次电子成象 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题力问题•观察样品表面的形态特征。

观察样品表面的形态特征图图3-17 3-17 四膜虫的扫描电镜图像（韩飞，丁明孝）　四膜虫的扫描电镜图像（韩飞，丁明孝）　一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理5. 5. 透射电子显微镜；透射电子显微镜；6. 6. 扫描电子显微镜扫描电子显微镜参见参见P25P25二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备略！第二章思考题第二章思考题1、为什么无菌技术和纯培养技术是微生物学建立与发展的、为什么无菌技术和纯培养技术是微生物学建立与发展的 基石？基石？2、试分析比较各种获得微生物纯培养方法的特点、试分析比较各种获得微生物纯培养方法的特点3、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察 方面的异、同进行概括、比较方面的异、同进行概括、比较4、你认为样品制备和显微观察中（、你认为样品制备和显微观察中（光镜和电镜光镜和电镜）应通过哪）应通过哪 些方法改变样品的反差以改善观察效果？些方法改变样品的反差以改善观察效果？5、、 试找到一篇使用微生物照片的科学文献试找到一篇使用微生物照片的科学文献（科研论文）（科研论文），， 分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微 观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪 些技术获得？些技术获得？。