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基于生物信息学方法探讨MEKK3蛋白K391位点突变与生物学活性MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的重要成员,可被一系列细胞外信号(如生长因子、细胞因子、环境应激等)激活[1],通过磷酸化的三级酶促级联反应参与炎症调节、细胞生长及凋亡等生物学过程其氨基酸序列包含N-端Phox1/Bem1p(PB1)结构域,C-端富含丝氨酸/苏氨酸残基的催化结构域,内含活化环,诱导T-loop内二聚物的形成可激活JNK、MAPK等,因此二聚化是激活MEKK3磷酸化的重要过程[2]催化结构域中391位的赖氨酸Lys(K)是一个ATP结合位点,对于MEKK3磷酸化相应底物发挥激酶活性非常重要磷酸化作用可使MEKK3蛋白结构发生改变,提高与底物的结合度,缓解催化区域位阻[3],从而参与信号分子的活化及信号传递过程研究表明,MEKK3参与激活多种神经相关的信号通路[4,5,6],还与帕金森病的发生及神经血管生成等神经生理病理活动相关[6,7,8]MEKK3与下游同样具有PB1结构域的MEK5结合,并将其磷酸化,激活ERK5信号通路[5]JNK通路是炎症发生过程中重要的信号通路,而炎症是介导神经元坏死的重要因素[9],MEKK3是如何介导JNK通路并诱发炎症性神经系统疾病目前尚无相关报道。

该研究采用生物信息学方法分析比较了野生型MEKK3WT及突变型MEKK3K391M蛋白质结构和性质的差异,并检测了其是否可以激活JNK以鉴定其活性,为研究MEKK3的相互作用分子及机制提供实验基础1、材料与方法1.1主要材料与试剂大肠杆菌DH5α、pCMV-Tag-2c、PC12细胞本实验室提供;转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;抗β-actin、p-JNKs、JNK多抗为Sigma产品,异硫氰酸荧光素酶标记二抗(来源于鼠)为Sigma产品;ProteinGPLUS-agarose(sc-2002)为SantaCruz产品;Tris碱,购自Sangon公司;胎牛血清及小牛血清购自GibcoBRL;硝酸纤维素(NC)膜,购自BoehringerMannheim;各种电泳ProteinMarker以及各种限制性内切酶购自MBI公司;总RNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司,免疫沉淀试剂盒购于上海碧云天公司1.2方法1.2.1引物设计与RT-PCR根据Genbank中所报道人的MEKK3基因编码序列(NM_203351),用Primer5.0软件设计上下游引物,同时在预突变的位置设计一对互补碱基引物,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

其引物的碱基序列如下:FLAG-MEKK3WT-F′(P1):5′GTCAGAATTCCAATGGACGAACAGGAGGCATTG3′FLAG-MEKK3WT-R′(P2):5′GTCACTCGAGGTGAGAGCTCAGTACATGAGC3′FLAG-MEKK3K391M-F′(P3):5′GAACTTGCTTCCATGCAGGTCCAATTTG3′FLAG-MEKK3K391M-R′(P4):5′CAAATTGGACCTGCATGGAAGCAAGTTC3′下划线部分分别为EcoRⅠ酶切位点G/AATTC与XhoⅠ的酶切位点C/TCGAG以PC12细胞为材料,提取总RNA,以此为模板用反转录试剂盒进行cDNA的合成,以cDNA为模板用引物(Pl、P2)经RT-PCR扩增出长约1896bp的全长片段MEKK3以反转录的cDNA为模板,用引物(P2、P3)和(P1、P4)经RT-PCR扩增目的片段,获得长约1200bp的上游片段和约700bp的下游片段,用此片段与引物(P1、P4)经重叠延伸PCR法扩增出长约1896bp的MEKK3K391M全长片段,取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

当RT-PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测发现阳性扩增带后,切下含目的基因的凝胶块,进行PCR扩增产物的纯化,纯化后的产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果1.2.2构建重组质粒FLAG-MEKK3WT及FLAG-MEKK3K391M将获得的MEKK3及突变体目的基因片段和质粒(pCMV-Tag-2c)经EcoRI和XholⅠ酶切,酶切片段在DNA连接酶作用下,连入pCMV-Tag-2c载体产生连接产物:FLAG-MEKK3WT/K391M,取5μL连接产物加入到制备好的感受态细菌DH5α中,将转化后的200μL细菌涂在含有相应抗生素的固体培养基上,孵育过夜待细菌长出后,选取白色菌落在含有相应抗生素的LB培养基中培养提取质粒,筛选阳性重组子委托上海英俊生物技术有限公司进行DNA序列分析1.2.3真核表达重组质粒在PC12细胞中的表达取测序正确的阳性重组子转染至PC12细胞,利用DNA中量制备试剂盒抽提需要转染的质粒,电泳分析并将质粒最终浓度调至1μg/μL,-20℃保存用于转染将PC12细胞传代至60mm一次性细胞培养皿中将DNA和脂质体分别加入无血清无双抗的DMEM培养基中,混匀,静置5min后将DNA与脂质体混合,放置20min,将已传代的PC12细胞用1mL无血清无双抗的DMEM培养基清洗一遍,加入DNA与脂质体混合物,再加入1mL无血清无双抗的DMEM培养基,37℃、5%CO2孵育箱内培养4h。

4h后,再加入2mL含20%胎牛血清的DMEM培养基,放入37℃、5%CO2孵育箱内常规培养20h后,将培养基换成含10%小牛血清加药或者不加药的DMEM培养基常规收集细胞,离心后保存于-20℃1.2.4蛋白样品制备及Western-blot免疫印迹分析将转染后的细胞用PBS收集,离心5min,弃上清加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,超声裂解,离心收集上清一部分用1×SDS电泳样品缓冲液煮沸变性,-20℃保存,另一小部分通过BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度取50μg蛋白提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压80V,200min)转膜,封闭,PBST洗3次(5min/次),加一抗4℃孵育过夜,PBST洗3次(5min/次),加二抗25℃避光孵育2h,PBST洗3次(5min/次),暗室曝光1.2.5生物信息学比较分析进入GenBank下载人源MEKK3的基因和氨基酸序列用ProtParam分析MEKK3蛋白质理化性质及稳定性;用ProtScale、TMHMM预测蛋白质的亲/疏水性和跨膜区;借助PredictProtien和Swiss-Model预测软件对蛋白质的二级和三级结构进行预测分析,用Swiss-PdbViewer3.7软件分析定点突变对MEKK3三级结构的影响。

PROVEAN[10]预测氨基酸替换对蛋白质生物功能的影响2、结果与分析2.1MEKK3蛋白的理化性质分析和预测借助ProtParam软件对MEKK3蛋白进行理化性质预测,并与MEKK3K391M进行比对人MEKK3蛋白由626个氨基酸组成,相对分子质量约为71kD,蛋白质等电点为9.02,说明MEKK3是碱性蛋白质在哺乳动物网织红细胞中预测的半衰期为30h、酵母体内大于20h、大肠杆菌细胞内大于10h,不稳定系数是59.97,高于40,根据不稳定指数的判断标准[11],推测MEKK3为不稳定蛋白疏水性平均值为-0.699,表明是亲水蛋白质对MEKK3K391M进行预测,显示相对分子质量不变;蛋白质等电点为8.95,与野生型蛋白大致相同;疏水性平均值为-0.690,点突变并未改变蛋白质亲/疏水性;蛋白的不稳定系数为59.47,虽然也高于40,但比野生型蛋白不稳定值稍低2.2预测与分析MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白亲/疏水性和跨膜区图1MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白的亲/疏水性图2MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白的跨膜区域预测2.3MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白二级结构的预测和分析图3MEKK3WT和MEKK3K391M蛋白的二级结构分析○为两者不同处2.4MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白的结构域和三级结构分析图4MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白的结构域2.5MEKK3WT与MEKK3K391M蛋白三级结构的预测和分析图5MEKK3蛋白三级结构及其同源蛋白质相似性波形图图6MEKK3三级结构及突变前后侧链基团的改变□为突变位点在MEKK3三级结构中的位置;→表示LYS391侧链基团;→表示MET391侧链基团2.6MEKK3相互作用蛋白分析使用STRING数据库分析预测与MEKK3相互作用的蛋白质,如图7所示。

图谱中标注了前10位与MEKK3相互作用的蛋白质,依次为:CCM2(分值:0.998)、TRAF6(分值:0.986)、MAP2K5(分值:0.982)、TAB1(分值:0.971)、RAC1(分值:0.970)、MAP2K3(分值:0.949)、MAPK14(分值:0.949)、RIPK1(分值:0.948)、MAP3K7(分值:0.948)、MAP2K4(分值:0.947)分析可知,与MEKK3相互作用的大部分是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)家族成员,它们之间也存在紧密的相互作用关系图7MEKK3蛋白的相互作用2.7MEKK3WT和MEKK3K391M重组体构建以PC12细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR的方法获得MEKK3全长cDNA,经重叠延伸PCR获得MEKK3K391M全长cDNA,构建重组质粒FLAG-MEKK3/K391M,筛选阳性重组子测序分析,2个重组子测序结果表明:FLAG-MEKK3与GenBank登记的序列完全一致;FLAG-MEKK3K391M成功将编码391位赖氨酸(Lys)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met)的密码子ATG,与预期结果完全一致,测序结果(部分)如图8所示。

图8MEKK3和MEKK3K391M测序结果(部分)2.8MEKK3WT和MEKK3K391M在PC12细胞中的表达转染FLAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M的PC12细胞,经细胞裂解液处理,SDS-PAGE分离后,以抗MEKK3的抗体进行免疫印迹分析结果表明,FLAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M均得到高效表达,如图9所示2.9MEKK3WT和MEKK3K391M蛋白生物活性鉴定将MEKK3WT和MEKK3K391M重组体转染PC12细胞,提取细胞总蛋白,进行免疫印迹分析,结果表明,JNK蛋白表达在MEKK3组和MEKK3K391M没有明显变化,而P-JNK在MEKK3组的条带明显深于对照组和MEKK3K391M组而P-JNK含量在MEKK3K391M组与对照组中相差不大结果表明,过表达MEKK3激酶能激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,P-JNK含量升高而MEKK3K391M失去活性,无法激活JNK,如图10所示图9FLAG-MEKK3WT/K391M在哺乳动物细胞中的异源表达图10MEKK3和MEKK3K391M生物活性鉴定3、讨论利用生物信息学手段分析预测了MEKK3蛋白的理化性质及跨膜区,结果表明MEKK3是碱性、亲水性蛋白质,MEKK3定点突变后其蛋白质亲水性以及跨膜区未改变,而稳定性有所增强。

对MEKK3蛋白及突变体二/三级结构分析表明,MEKK3K391M中激酶活性位点的改变影响了α-螺旋区和β-折叠在蛋白质中的分布,同时该位点失去与化学物质结合的能力MEKK3蛋白K391突变为M391,靠近反应中心的原子侧链占有的空间位置变大,增大了空间位阻,导致MEKK3与ATP结合的难度加大,从而无法呈递磷酸基团催。