临床微生物检验_实验五.ppt

临床微生物学检验第五个实验周2013检本,目的要求 1.掌握下呼吸道标本的分离培养及检测方法 2.掌握的铜绿假单胞菌形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法 3.掌握流感、副流感嗜血杆菌形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法,,菌种试剂 菌种：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡菌 球菌 标本：模拟痰标本 主要试剂：X、V、XV因子纸片，氧化酶试剂， 革兰染色液 不发酵细菌微量生化编码管,第一天实验内容,模拟痰标本 分离培养：接种（1个大血平/人+1个Mac/人+1个巧克力/人） 涂片干燥固定后革兰染色 流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌： 菌落观察、涂片干燥固定后革兰染色 卫星试验（1个小血平板/人） 因子试验（MH平板 1个/人） 转种巧克力平板（2个/组）,痰液及上呼吸道标本 肉眼观察 培养前处理 直接涂片检查 血平板、Mac 特殊细菌培养 初报 巧克力平板 选择适当培养基和条件 菌落观察 分离鉴定 涂片 纯培养 生化鉴定 药敏 最终报告,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,合格痰标本：白细胞25/低倍视野，鳞状上皮细胞10/低倍视野,洗痰、胰酶均质化,嗜血杆菌属,形态：G-b 细小 呈球杆状 短丝状或多形态 培养：5-10%CO2 营养要求高 生长需X或V因子 巧克力平板 菌落: 直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、 无色或灰白色半透明小菌落,革兰阴性短小球杆菌（有多形性）,溶血嗜血杆菌革兰染色结果,培养基：巧克力平板 血液中含有X、V因子，V因子处于抑制状态，加热80-90 10-15min可破坏V因子的抑制物使V因子发挥作用。

巧克力琼脂中加入抗生素可提高检出率,菌落特征: 巧克力平板上无色或灰白色半透明小菌落 卫星试验：金葡菌能合成释放V因子，在金葡菌菌落 周围，流感嗜血杆菌菌落较大，远离则小 因子试验：MH平板上贴上X、V、XV因子纸片， 不同嗜血杆菌会在所需因子纸片周围生长,副流感嗜血杆菌,流感嗜血杆菌,,卫星试验（血平板）,,,,,,金黄色葡萄球菌（划线或点种）,流感嗜血杆菌（密集涂布于平板上）,,卫星试验阳性结果,,嗜血杆菌（密集涂布于平板上）,,,,,,,,,XV,V,X,因子试验（MH平板）,操作方法、注意事项,XV生长，V生长,,,因子试验结果,第一天实验内容,模拟痰标本 分离培养：接种（ 1个大血平/人+1个Mac/人+1个巧克力/人） 涂片干燥固定革兰染色 流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌： 巧克力平板上菌落观察、涂片干燥固定革兰染色 卫星试验（1个小血平板/人） 因子试验（1个MH平板/人） 转种巧克力平板（2个/组）,,部分接种流感，部分接种副流感,,一个接种流感嗜血杆菌，一个接种副流感,,,,金葡点种或划线,,第二天实验内容,嗜血杆菌：观察分区划线结果，观察菌落特点 卫星现象结果观察 因子试验结果观察 痰标本：血平板菌落观察和革兰染色、氧化酶试验 麦康凯和巧克力平板上菌落观察 根据染色、氧化酶试验结果接种相应的微量生化编码系统（非发酵菌微量生化编码系统）,,,流感嗜血杆菌培养24h菌落,菌落: 直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、 无色或灰白色半透明小菌落,流感嗜血杆菌培养48h菌落,流感嗜血杆菌卫星试验阳性结果,流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌卫星现象结果（二者卫星现象均阳性，上面“+”，下面“-”）,溶血嗜血杆菌的卫星试验阳性,流感嗜血杆菌卫星试验阳性,,,副流感嗜血杆菌因子试验结果,副流感嗜血杆菌因子试验结果,流感嗜血杆菌因子试验结果,X+V因子周围生长,,,流感嗜血杆菌因子试验结果,X+V因子周围生长,,流感嗜血杆菌因子试验结果,X因子 V因子 溶血 流感嗜血杆菌 + + - 副流感嗜血杆菌 - + -,,,,X因子 V因子 溶血 流感嗜血杆菌 + + - 溶血嗜血杆菌 + + + 副流感嗜血杆菌 - + - 副嗜沫嗜血杆菌 - + - 副溶血嗜血杆菌 - + + 杜克雷嗜血杆菌 + - - 嗜沫嗜血杆菌 - - -,,,几种嗜血杆菌对生长因子需求,,,,,,,,普通平板,产绿脓素、青脓素琼脂被染成黄绿色,金属光泽、特殊气味、-溶血环,金属光泽、特殊气味、-溶血,普平： 菌落圆形、大小不一、边缘不整、 扁平、湿润、常呈融合态，特殊气味、琼 脂被染成绿或黄绿色。

血平： 类似普平菌落，特殊气味，有金属光泽、 有溶血铜绿假单胞菌菌落形态,染色形态：G-b 菌体长短不一 球杆状或长丝状 培养特性：专性需氧 营养要求不高 可形成多种不同形态的菌落 产黄绿色色素,铜绿假单胞菌,革兰染色,铜绿假单胞菌,G-b、菌体长短不一 、球杆状或长丝状,,可疑菌落 涂片革兰染色 革兰阴性杆菌 氧化酶(+) 非发酵菌鉴定系统鉴定到种,,,,,非发酵菌微量生化鉴定系统,,,,,第三天实验内容,1. 不发酵菌微量编码系统结果判断 痰标本鉴定结果报告 2. 小测验,非发酵菌微量生化鉴定系统,,,,DNA酶试验原理：甲基绿与长链DNA结合呈绿色，寡核苷酸溶于酸不与甲基绿结合，呈灰白色精氨酸双水解酶试验 （在非发酵菌鉴定中不加石蜡油） 原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳 鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来乙酰胺利用试验 原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱非发酵菌微量编码系统结果判断,枸 橼 酸 盐,麦 芽 糖,精 氨 酸,甘 露 醇,木 糖,乙 酰 胺,D N A,硝 酸 盐,葡萄糖(厌氧),葡萄糖(需氧),,,,,,,,,,,氧 化 酶,,,I II III IV,,,2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1,。