第十五章动植物细胞大规模培养技术原理.docx

第十四章动植物细胞培养动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长动植物细胞培养与微生 物细胞培养有很大的不同（表14-1）0市于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附看 在I古I体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半 乳糖外，还需有血清动物细胞对环境敏感，包括pH值、溶氧、CO”温度、剪切应力都比 微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制相比Z下，植物细胞对营养要求较动物细 胞简单但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，而且植物细胞 生长较微生物要缓慢，因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产备种酶、抗生素、蛋白 质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒索、疫苗、干扰索、单克隆抗体、 色素、香味物质等，必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得从20世纪50年代以来, 这方瓯已取得一些进展但是，H前的技术还远不能满足细胞生物产品M用的要求，随肴动 植物培养技术研究的深入，显示岀广阔的发展前景表14-1动植物、微生物细胞的培养特征比较项目微生物动物细胞植物细胞大 小1-10 u m10〜100 u m10-100u m悬浮生长可以多数细胞需附着表面可以，但易结团，无才能生长单个细胞营养要求简单非常复杂较复杂生长速率快,倍增时间0.5〜5小慢，倍增时间15-100慢，倍增时间24〜74时小时小时代谢调节内部内部、激素内部、激素环境敏感不敏感非常敏感能忍受广泛范围细胞分化无有有剪切应力敏感低非常高高传统变异，筛选技术广泛使用不常使用有时使用细胞或产物浓度较高低低第一节动物细胞大规模培养技术动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。

1962 年，其规模开始扩大，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展发展至今己成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利川动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因了、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分其发展简史见表14-2利用动物细胞培养技术生产的生物制品LlrhW：界生物高技术产品市场份额的50亂 大量资料表明，生物技术药物是当前新约开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市美国报新预测几种畅销基因丁•程药物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G2CSF大于20亿美元,IIGII、IFN、IK均大于10亿美元,朕岛素和降钙素大于5亿美元动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节 目前，动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上表14-2动物细胞培养技术的发展年份技术发展概要1907年1951 年1957年Harrison创立体外组织培养法Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。

Graff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的IX 10⑴〜2X10 cells/L的记录，标志着现代灌注概念的诞生1962年Capst订e成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BIIK),标志着动物细胞大规模培养 技术的起步1967年1975年Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50为载体培养动物细胞获得成功等在培养基中用激索代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成 功，预示着无血清培养技术的诱人前景1975年Kobhler和Ulstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预 定单克隆抗体的杂交瘤细胞1986年1989DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细 胞培养工艺中优化控制之理论一、 动物细胞形态(1) 成纤维细胞型(fibrlblast或mcchanocyte type)这种细胞形态与体内成纤维细胞 形态相似故而得名细胞体呈梭形或不规则三角形，有圆形核，胞质向外伸出2〜3个 长短不同的突起细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行［如 图14-1 (a)］o除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他纽织细胞，如血管内皮、 心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。

实际上很多所谓成纤维细胞并无产生 纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法2) 上皮细胞型(epithiliuiTi cell type)这种细胞呈扁平的不规则三用形，有圆 形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片［如图14-1 (b)］,起源于外胚层和内胚层组织的细 胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)肠管上皮、肝、月夷和肺泡上皮细胞培养时皆 呈上皮型3) 游走细胞型(wondering cell type)这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不 连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而H方向不规 则［如图14- 1(c)］此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如 培养基化学性质变动等，它们也可能变为成纤维细胞型4) 多形性细胞型(polymorphic cell type)除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞, 如神经纟R织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞［如图14-1 (d)］o上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生 长但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变5) 悬浮型细胞这类细胞常呈闘形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。

如血液细 胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养二、 动物细胞培养基组成及制备1、培养基的组成动物细胞培养的培养基分为天然培养基和合成培养基两大类天然培养基使川最早，营 养成分高，也最为有效但成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制动物 血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，血清含有丰富的营养物质，包括大分了蛋白质和 核酸等，对动物细胞的生长繁殖具有促进作用同时，血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用, 且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害图14-1动物细胞形态(a)成纤维细胞型；(b)上皮细胞型：(c)游走细胞型；(d)多形性细胞型合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具冇一定的组成但这 种模拟不是被动和不加选择的，而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的 人T合成培养基这种培养基在很多方面有天然培养基无法相比的优点它给细胞提供了一 个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境目前所有细胞培养室都己采用 经标准化生产、纟R份和含量都相对尚定的备种合成培养基，如Eagle基木培养基和更复杂的 NCTC109, TC199, HEM, DME, RPM11640, McCoySA, HAMF12 等。

尽管现代的合成培养基成份 和含量己经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要在合成培养基中都或 多或少的要加入一定比例的灭然培养基加以补充目前多采川胎牛血清、小牛血清、马血清 等，比例从百分Z几到百分Z几十不等，要根据需要而定其他备种天然培养基也可根据需 要加入合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些 其它辅助性成分1) 氨基酸必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必 需氮基酸，另外还需要半胱氮酸和酪氮酸而且rh于细胞系不同，对备种氮基酸的需要也不 同有时也加入其他非必需氨基酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，艮平衡可 影响细胞存活的生长速率在细胞培养中，大多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源2) 维生素Eagle基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血清中取得血 清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，它们也必不 可少维生素限制可从细胞存活和生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标⑶碳水化合物 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分, 主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等。

4) 无机盐无机盐是细胞的重要组成部分么一，它们积极参与细胞的代谢活动无机 盐中N【、K\ Mg2\ Ca2\ Cl\ SO产、P0广和HCO「等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透 压的主要成分对悬浮培养，要减少钙，可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相C02 浓度有关5) 有机添加剂 复杂培养基都含有核廿、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还 原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等及其他各种化合物同样，当血清量减少时，必须添加这种化 合物，它们对克隆和维持这些特殊细胞有益⑹血清 纽•织细胞培养中常用的天然培养基是血清这是因为血清中含有大量的蛋白 质、核酸、激素等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，粘附及中和某些物质的毒性起着 一定的作用最常用的是小牛血清，胎牛血清人血清用于一些人细胞系大多数动物细胞 培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，细胞可在无血清条件下维持和增殖目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品其成分趋于简单化, 以能维持细胞生长的最低需求，而去除了不必要的成份同时为适皿某些特殊培养的需要补 加一些新的成分，如培养杂交瘤细胞时采用DMEM培养基需补加内酗酸钠和2-硫基乙醉；为 增加细胞转化和DXA合成，有时补加植物血凝素（PHA）等。

这些变化需根据实验和细胞的具 体要求而定2、培养基制备以及制备过程中应考虑的因素虽然各种培养基的组成备有不同、但形成商品化的干粉型培养基的配制方法却大同小 异绝大多数合成培养基的生产都己标准化、商品化较为常用的培养基市场上很容易购得 这种干粉型培养基性质稳定，便于储存、运输、价格便宜，给使用和配制合成培养基带来很 大方便一般的特殊需求也多可在现有合成培养基基础上补加或调幣某些成份予以满足以 往实验室自购各个纟R份，称量后再按一定顺序进行溶解配制的老方法，一方面需购置大量各 种备样的成份，而且每种成份用量很少，很难控制和统一；另一方面要精确称量，顺序溶解, 步骤繁琐，质量难以保证除了因特殊需要而专门配制一些特殊培养基外，大部分已不再使 用在制备培养基时，通常要考虑以下因素：⑴PII值 多数细胞系在pll=7. 4下生长得很好尽管备细胞株2间细胞生长最佳pll值 变化很小，但一些正常的成纤维细胞系以pH二7. 4〜7. 7最好，转化细胞以pH二7. 0〜7. 4更合 适据报道，上皮细胞以pH二5. 5合适为确定最佳pH值，最好做一个简单的生长实验或特 殊功能分析酚红常用作指示剂，pH二7. 4呈红色，pH二7. 0变橙色，pH=6. □变黄色，而pH二7. 6呈红 色中略带蓝色，pll二7.8呈紫色。

由于对颜色的观察有很大的主观性，因而必须川无菌平衡 盐溶液和同样浓度的酚红配一。