第三组-荧光寿命成像(-84).pptx

荧光寿命成像及应用深圳大学光电工程学院第三小组：豆秀婕、王昱鑫、乔文、王凯王凯乔文王昱鑫豆秀婕荧光寿命成像原理及测量方法荧光探针荧光寿命的应用. 荧光寿命的应用及展望.团队 分工. . 荧光寿命成像的原理荧光寿命的定义荧光寿命的测量方法目录荧荧光寿命成像技术简术简 介荧光寿命成像显微(FLIM)技术将荧光显微与时间 分辨 荧光测量技术相结合,通过逐点测量样品的荧光寿命,提供 细胞或组织样 品荧光寿命的空间分布荧光光谱技术和荧光显微技术可揭示样品中荧光团的 组分和分布.但以往荧光分析或成像技术大多基于荧光强度的测 量,容易受激发光强度、样品猝灭和荧光染料的分布浓度等许多因 素的影响,因此难以做到定量测量.荧光寿命的测量一般来说是绝对的,不受激发光强度变化、 荧光团的浓度和光漂白等因素的影响,且不受其他限制强度测量因 素的制约,仅与荧光团所处的微环境密切相关因此,通过对样 品 进 行荧光寿命成像(FLIM),可以对分子所处微环境中的许多生物物 理、 生物化学参数如pH值、离子浓度、氧压、溶液疏水性及猝灭剂等 的分布进行定量测量荧光寿命的定义荧光寿命的定义荧荧光强度衰减曲线线荧荧光寿命的测测量方法7时域法是用超短光 脉冲激发样品,然后 测量样品在受到光 激发后不同时刻所 发出的荧光的强度, 最后根据荧光强度 的衰减规律来分析 并计算荧光寿命 值。

在频域法中,用强度 按正弦调制的激光激 发样品,荧光的强度 也是按正弦调制的. 二者调制频率相同, 通过测量荧光相对于 激发光的相移及解调 系数计算荧光寿命 值荧光寿命的测量方法 主要有时域法和频域法时域法测量原理时域法荧光寿命成像的原理图.根据所测得的样品中各点的荧 光强度衰减曲线来拟合分析并计算 荧光寿命值一种简单的情况是单组分荧 光寿命的测量,这时只需在样品受 到脉冲光激发后两个不同时刻分别 测量荧光强度的衰减时域法测量门控探测法 (time-gated detection) 01.时域法荧光寿命的测量和荧光寿命成像扫描相机测量法 (streak-FLIM)03.时间相关单光子计数法 (time correlated single photoncounting , TCSPC) 02.门控法测量典型门控荧光寿命成像系统框图生物荧光寿命成像装置通常由 激发光源、光电探测器成像器件) 、延迟装置及图像处理设备组 成门控装置的光源通常为短脉宽 超快激光器，CCD是常见的成像设 备，延迟装置提供FLIM的控制信 号，荧光寿命可通过在两个不同延 迟时刻开启的相同宽度的门内记 录的荧光强度信息求得。

光电探测器及CCD等成像器 件输出的都是光强度信息,需要利 用强度信息图像反演出荧光寿命图 像门控探测法门控探测法适于单组分荧光强度衰减的测量和荧光寿命成像，通过延 时电路以及选通时间窗口获取两幅不同时刻的强度图像，最后通过荧光光 强单指数衰减的公式，计算出荧光寿命 门控探测示意如图：时间时间 相关单单光子计计数法TCSPC时间相关单光子计数法测量荧光寿命通过大量测量样品在受到脉冲光 激发后荧光光子到达探测器的时间,从而得到荧光强度的衰减规律 TCSPC 的工作原理如图1:时间相关单光子计数法以光子数对时间 作图可得到如图2 所示直方图, 此图经过 平滑处 理得到荧光衰减曲线扫扫描相机测测量法扫描相机是一种具有极高时间分辨率和灵敏度的探测器,它可以获取一 维空间或光谱的时间分辨信息扫扫描相机测测量法该系统由皮秒二极管激光器、荧光显微镜、扫描相机、扫描振镜 系统以及计算机等组成用三角波驱动X方向扫描振镜Gx,对从皮秒脉冲激光器输出的光 脉冲进行线扫描,并通过与奥林巴斯显微镜耦合的中间光学系统,将线 扫描光束聚焦到样品上对样品进行激发,样品所发出的荧光被显微物 镜收集,透过双色镜后成像到扫描相机的光电阴极上。

用步进扫描信号驱动Y方向扫描振镜Gy,对样品进行扫描方向垂 直于Gx的步进线扫 描,以获得对整个样品的测量和成像扫描相机对 一维的荧光信号进行时间分辨,最后通过CCD保存到计算机里,通过 Gy的步进扫描以及图像处理软件,就可以得到细胞的荧光寿命图像频域法测量频域法是用强度按正弦规律调制的激光激发样品,荧光强度按正弦 调制,且两者调制频率相同,通过测量荧光相对于激发光的相位差及解 调系数来计算荧光寿命值.对于不同的样品可选择不同的调制频率,从 而可扩大荧光寿命的测量范围频域法荧光寿命成像原理图：B频域法测量设激发光调制角频率为ω，荧光相对于激发光的相移为 , ,可以得到相 位延迟与荧光寿命的关系:而调制系数M与荧光寿命 的关系：当两值相等时为单 指数拟合,若不相等，表明当存在多种荧光分子就 需要多指数拟合计算荧光寿命理论基础待续 未完荧荧光探针针王昱鑫荧荧光探针针v荧荧光探针针一般由两部分组组成，荧荧光团团以及识别识别 基团团荧荧光团团决定了探针针的基本参数，识别识别 基 团团与靶标标生物分子特异性结结合荧荧光探针针的一些重要参数v斯托克斯位移(Stokes shift)发发射波长长与吸收波 长长的差值值称为为斯托克斯位移，它是影响荧荧光探针针灵 敏度与选择选择 性的重要参数。

v摩尔消光（吸收）系数(ε)吸收系数是度量光子吸 收效率的重要参数表征一个分子吸收光的能力 v量子产产率(Φ)量子产产率是反映物质质将吸收光转转化 为荧为荧 光的效率的重要参数，直接影响荧荧光强度它定 义为发义为发 射光子数目与吸收光子数目的比值值 v荧荧光强度荧荧光强度是指发发射荧荧光的强度，是由摩 尔消光（吸收）系数与量子产产率的乘积积决定的荧荧光 强度决定了荧荧光检侧检侧 的灵敏度 v荧荧光寿命荧荧光寿命也称激发态发态 寿命，是指一个分 子的激发电发电 子停留在激发态发态 的平均时间时间 多数荧荧光 分子荧荧光寿命在纳纳秒数量级级荧荧光探针针的分类类：v小分子荧荧光探针针 v荧荧光蛋白探针针 v量子点荧荧光探针针单单光子激发发的小分子荧荧光探针针(1)用于检测检测 金属离子的小分子荧荧光 探针针金属离子的小分子荧荧光探针针一般由两部分组组 成，荧荧光团团以及配体部分配体用来特异性识别识别 金属离子当配体部分 与金属离子结结合时时，荧荧光团团的荧荧光参数会发发生 变变化，通过检侧过检侧 参数的变变化就可以反映金属离子 的信息荧荧光团团分类类及作用机理：分类类：按照荧荧光团发团发 生荧荧光变变化的主要机理分类类，主 要有光致电电子转转移(PET)探针针、光致电电荷转转移 (PCT)探针针以及激发态发态 二聚体探针针等。

荧荧光团团分类类及作用机理：作用机理： vPET是指当电电子给给体(配体部分)的电电子转转移到电电子 受体(荧荧光团团)上的时时候，会使含有芳香基的荧荧光团团 发发生荧荧光猝灭灭的现现象; v当配体部分与阳离子结结合时时.电电子转转移受到限制，荧荧 光恢复当荧荧光团团上同时时有给电给电 子基团团与拉电电子基 团时团时 ，光激发发后，会产产生分子内PCT，造成斯托克 斯位移的变变化 v激发态发态 二聚体探针针指单单体探针针受到阳离子作用后会 发发生二聚，单单体与二聚体的比例受到所测测阳离子的影 响，这样这样 就可以通过测试荧过测试荧 光的变变化得到待测测离子 的信息技术术改进进和待解决问题问题 ：v为为了对对细细胞内的金属离子进进行成像，一般将探针针 上羟羟基转转化为为相应应的乙酸酚脂，羧羧基转转化为为乙 酰酰氧甲酯酯，以增大探针针的膜通透性 v虽虽然已经经出现现了大量的检侧检侧 阳离子的探针针，但是 仍然存在很多问题问题 需要人们们解决例如，相似离 子的干扰扰、提高探针针的选择选择 性、探针针的响应时应时 间间等问题问题 2)用于检测检测 阴离子的小分子荧荧光探 针针生物体系中大多数酶以阴离子为为底物或者 辅辅助因子，因此设计设计 合成用于阴离子检测检测 的小分 子荧荧光探针针也引起人们们的关注。

例如，Cl-1是生物体系内广泛存在的一种 阴离子SPQ是一种常用于检测检测 Cl-1的探针针， Cl-1会使该该探针发针发 生碰撞荧荧光猝灭灭，猝灭灭程度与 Cl-1浓浓度相关3)用于检测检测 活性氧的小分子荧荧光探 针针v活性氧是含有氧原子的活性分子，包括氧离子、 过过氧化物和含氧自由基等有机物和无机物 v现现已有多种商业业化探针针用于检测检测 活性氧这这些探 针针本身不带荧带荧 光或者荧荧光很弱，在被生物体内活 性氧氧化后发发出强荧荧光4)用于检测检测 酶活性的小分子荧荧光探 针针v酶的活性可以应应用具有分子内FRET（荧荧光共振 能量转转移)功能的小分子荧荧光探针针得到测测定 v利用FRET原理设计设计 的探针针能够实现够实现 比率测测定， FERT效应应能够够造成很大的光谱谱移动动，提高了测测 定的精确度5)用于对细对细 胞结结构成像的小分子荧荧 光探针针v该类该类 探针针一般由特定细细胞器的识别识别 基团团与荧荧光 团团复合而成绿绿色荧荧光蛋白及类类似物(1)绿绿色荧荧光蛋白的基本知识识v 绿绿色荧荧光蛋白的化学结结构GFP蛋白是桶状结结构， 11条β折叠绕绕成一个圆圆柱 体，一条α螺旋处处于中轴轴 位置，荧荧光团团附着在α螺 旋上，正好处处在圆圆筒的中 央位置，得到很好的保护护 ，避免了荧荧光碎灭现灭现 象。

GFP蛋白中几乎所用的氨 基酸都用来形成β折叠或α 螺旋，荧荧光性能取决于整 个分子的一级结级结 构，保证证 了其独特的荧荧光性能绿绿色荧荧光蛋白的发发光机理（图图10-6 ）GFP蛋白的发发色团团是位于氨基酸序列65一67位的Ser-Tyr—Gly( 残基)通过过自催化形成的对羟对羟 基亚苄亚苄 基吡唑唑琳酮酮.绿绿色荧荧光蛋白折叠成天然 构象后，Gly67的酰酰胺亲亲核进进攻Ser65的羧羧基，然后脱氢氢形成咪唑唑啉酮酮， 最后氧气使Tyr66的α, β-键键脱氢氢，使得它的芳基与咪唑唑啉酮酮共轭轭在这这个 阶阶段发发色团团就可以吸收可见见光发发出荧荧光绿绿色荧荧光蛋白的性质质：vGFP蛋白特殊的结结构对发对发 色团团有很好的掩蔽作用 ，使得GFP的荧荧光有很好的稳稳定性人们们也不断 设计设计 新型GFP突变变体，使其具有更加优优良的性能 目前主要的改造方式有替换换生色团团的氨基酸、 对对碱基组组分进进行优优化、增强启动动子等2)绿绿色荧荧光蛋白在分子成像中的应应 用v绿绿色荧荧光蛋白因其具有荧荧光强、荧荧光稳稳定、检检 测测方便等优优点 v 绿绿色荧荧光蛋白主要应应用在以下几个方面:作为报为报 告基因、作为为融合标签标签 、作为为生物传传感器等。

v检测检测 基因表达绿绿色荧荧光蛋白在生物体内的首次 应应用是作为报为报 告基因检测检测 目标标基因的表达水平， 在转转基因研究中GFP得到了广泛的应应用 v由于GFP灵敏度较较低，人们对们对 其进进行了改进进提 高其荧荧光强度另外一种办办法是只在某个特定区 域进进行表达，提高GFP浓浓度，以没有表达GFP的 细细胞区域作为为参照 v作为为融合标签标签 绿绿色荧荧光蛋白可以与其他一些目 的基因形成融合蛋白，基本不影响主体蛋白的空 间间构象和功能，用于检测检测 主体蛋白的定位、迁移 、分子间间相互作用以及空间间构象变变化等vGPP蛋白作为细为细 胞器靶向标记标记 物，将GFP定位 到特定的细细胞器对对其进进行实时观测实时观测 目前已成 功标记标记 的细细胞器有细细胞膜、细细胞核、内质质网、高 尔基体、分泌囊泡、线线粒体、过过氧化物酶体、液 泡等GFP另外一个重要的应应用：v GFP另外一个重要的应应用是研究蛋白质质分子之 间间的相互作用以及空间间构象变变化 v这这方面的研究主要应应用FRET进进行检测检测 ，一般情 况下用GFP与YFP(黄色荧荧光蛋白)分别别作为给为给 体荧荧光团团与受体荧荧光团团。

将GFP与YFP融合到 同一个主体蛋白上就可以研究主体蛋白质质的空间间 构象变变化。