防腐挑战实验.doc

第一部分 防腐挑战实验调研结果1 实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为 300g2 微生物挑战性实验2.1 实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择 的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐 的菌种（因其较具代表性，如表2 所示），所以更为恰当注意菌株来源问题：同属一个种 的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验 的测试菌株美国美国英国德国德国菌株(药典 )(ISP 公司 )(药典 )(Henkel 公司 )(S&M 公司 )白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√绿色木霉√绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√产气肠杆菌√表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√表 2CTFA 化妆品微生物挑战试验 的菌株选择种类菌株数量金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌至少选一种表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母酵母至少选一种近平滑假丝酵母黑曲霉霉菌至少选一种黄绿青霉产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基2.3 试验用菌液 的配置（1）标准悬液 的配制1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成 的悬液浓度为 3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。

2）细菌菌悬液 的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上， 36 摄氏度恒温培养 48 小时将已培养好 的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀 用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液 的浊度（ 3× 108cfu/ml ）相同为止；此时 的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需 的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌总数确定细菌数3）霉菌菌悬液 的配制将已培养好 的活性菌种， 用灭菌 的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中， 充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次 的 10 倍稀释，每次 的稀释用血球计数板计数，必须 5 个中格 的霉菌总数在 190～ 210，落在此范围内 的菌悬液为我们所需 的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数2.4 接种2.4.1 接种方式（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验这种方法 的优点是容易了解每种微生物对防腐体系 的敏感性， 在筛选产品 的防腐体系时有较好 的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品 的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界 的微生物常常不是单一 的种类） 2）混合菌接种：西欧、德国等 的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染 的状况。

2.4.2 接种次数和时间（ 1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期 28 天一次加菌 的 28 天微生物挑战实验）（ 2）多次接种：在试验开始接种一次后 （重复加菌 的微生物挑战实验） a 法：第 21 天再接种一次，试验周期为 28 天有实验表明，第 21 天接菌和不接菌时，第 28 天时 的微生物含量并无显著 的差别，评定结果也相同）b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第 1、 3、 5 周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为 49 天；c 法：每周接种一次，连续 5 次，试验周期为 35 天S&M 公司 的资料介绍，采用此种方法评价认可 的防腐体系，可保证产品 30 个月内 的防腐安全）2.4.3 操作方法称取待测样品 30g，对应加入 0.3ml 浓度为 1×107～1×108 cfu/ml 的细菌悬液及霉菌悬液，用干净 的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在 32.5± 2.5℃ 的培养箱中培养，霉菌在 22.5± 2.5℃ 的培养箱中培养a.水溶性样品10g 加入 90ml 无菌生理盐水，稀释后取 1ml 样品液，加入 9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为 10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、 10-7 等稀释度；取三个合适稀释度 的样液， 分别吸取 1ml 样液加入已灭菌 的平皿中， 做菌落计数，并做两个平行。

b.油溶性样品取 10g 样品，加入 10ml 无菌吐温 -80 和 10ml 无菌白矿油，再加 70ml 无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；吸取 1ml 已稀释 的样品液， 加入 9ml 灭菌生理盐水中， 做依次稀释， 分别为10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 等稀释度；取三个合适稀释度 的样液，分别吸取 1ml 加入已灭菌 的平皿中，做菌落计数，并做两个平行2.5 培养细菌放在 32.5±2.5℃ 的培养箱中培养；霉菌在 22.5± 2.5℃ 的培养箱中培养；混合菌在 28℃ 的培养箱中培养2.6 菌落计数分别在 0、7、14、 21、28 天分离计算样品中活 的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱， 以待下次观察用， 观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察菌落计数 的标准方法：①先选取平均菌落数在 30～300 之间 的平皿作为细菌菌落总数测定范围， 选取平均菌落数在 5～ 50 之间 的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；②有两个稀释度在 30～300 之间，求比值若比值≤ 2，报告平均数；若比值 >2，以其中较小 的稀释度计算细菌总数；③所有稀释度都大于 300，以稀释度最高 的平均菌落数计算；④所有稀释度都小于 30，以稀释度最低 的平均菌落数计算；⑤所有稀释度均在 30～300 之外，其中一个大于 300，而相邻 的加一稀释度小于 30，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数计算；⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；⑦若片状菌落不到平皿中 的一半， 而另一半中菌落均匀， 则可将此平皿菌落计数后× 2，以报告全皿菌落数。

2.7 评价标准2.7.1 CTFA 推荐 的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA 的方法初始 的霉菌和细菌 的接种量分别为 10000cfu/g（ ml ）和1000000cfu/g（ ml）（CFU 为菌落单位），要求在第 7 天时霉菌降低 90%，细菌降低 99.9%，并且在 28 天内菌数持续下降2.7.2 美国评价标准在 CTFA 评价方法 的基础上提出 的标准，如表 3 所示表 3美国所用一次加菌 的微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌 的 28 天微生物挑战实验防腐效果优良若单菌接种 的三个平行试验中任何一种微生物数量 的平均值，在第七天时下降到 100 cfu/g （ ml）以下，第28 天全部为 0防腐效果勉强通过若单菌接种 的三个平行试验中任何一种微生物数量 的平均值，在第七天时下降到 1000 cfu/g （ ml ）以下防腐效果无效若单菌接种 的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到 CTFA 的要求2.7.3 国内评价标准国内参照 CTFA 加菌防腐挑战性评价标准表 4 国内所用微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌 的 28 天微生物挑战重复加菌 的微生物挑战实验实验防腐效果优良（ W ）第 28 天化妆品中存货 的细菌在三次加菌后， 在每次加菌 的数量 <10CFU/ml ，说明该样品第 14 天样品中存货 的细菌数防腐体系对细菌有较强 的抑<100CFU/ml杀效果。

防腐效果尚可（ M ）第 28 天化妆品中存货 的细菌在三次加菌后， 在每次加菌 的数量 <100CFU/ml ，说明该样第 14 天样品中存货 的细菌数品防腐体系对细菌有一定 的<1000CFU/ml抑杀效果防腐效果差（ P）第 28 天化妆品中存货 的细菌在三次加菌后， 在每次加菌 的数量 >100CFU/ml ，说明该样第 14 天样品中存货 的细菌品防腐体系对细菌有较差 的数 >1000CFU/ml抑杀效果第二部分 实验室可采取 的方案1 实验样品2 微生物挑战性实验2.1 实验菌株金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基2.3 试验用菌液 的配置实验前，将各菌株接种于合适 的培养基中，于 37℃（细菌）和 28℃（霉菌）培养箱中培养细菌培养 2 天，霉菌培养 5 天后，挑选典型 的菌落于灭菌 的生理盐水中， 制成一定浓度 的混合细菌（ 10^8CFU/ml ）和霉菌悬液（ 10^6CFU/ml ），置于 4℃冰箱储藏备用2.4 一次加菌 的 28 天微生物挑战实验量取样品 30ml 分别加 0.3ml 混合菌悬液，使得细菌浓度为 10^6~10^7CFU/ml ，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml ，充分混匀。

将样品在 28 摄氏度下保存，在接菌 0、 7、 14、 21、2。