荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用.ppt

荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用导导  师：张玉奎师：张玉奎  学学 生：张生：张 琳琳中科院大连化学物理研究所中科院大连化学物理研究所1810组组§ 引言引言 § 常用常用荧荧光衍生化光衍生化试剂应试剂应用用简简介介        § 展望展望 汇报内容汇报内容§ 衍生的目的衍生的目的§ 衍生发应方式衍生发应方式§ 荧光衍生试剂的构成荧光衍生试剂的构成引引 言言衍生化反应方式衍生化反应方式衍生化反应方式衍生化反应方式§ (on line)§ 离线离线 (off  line) 从衍生反应的场所来分从衍生反应的场所来分 § 柱前衍生化柱前衍生化 (pre-column derivatization)§  柱上衍生化柱上衍生化 (on-column derivatization)§  柱后衍生化柱后衍生化 (post-column derivatization) 从是否与仪器联机的角度来分从是否与仪器联机的角度来分 从是否形成共价从是否形成共价键键来来分分§ 标记标记§ 非标记非标记 荧光衍生试剂的基本构成荧光衍生试剂的基本构成荧光衍生试剂的基本构成荧光衍生试剂的基本构成取代基荧光团（试剂分子母体）反应基团胆磺酰肼 DNS-HI I 胺类化合物的衍生试剂胺类化合物的衍生试剂胺类化合物的衍生试剂胺类化合物的衍生试剂 § 芳香邻二醛类 OPA§ 异硫氰酸酯类 FITC§ 酰氯类 FMOC§ 活性卤类 NBD-Cl§ N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类 AQC 邻苯二甲醛邻苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并恶二唑苯并恶二唑 NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC常用胺的衍生试剂常用胺的衍生试剂常用胺的衍生试剂常用胺的衍生试剂 分子式分子式分子式分子式邻苯二甲醛邻苯二甲醛邻苯二甲醛邻苯二甲醛 OPA OPA 衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图J Chromatorgr. 1990,499:557集成化微流控芯片氨基酸分析仪集成化微流控芯片氨基酸分析仪集成化微流控芯片氨基酸分析仪集成化微流控芯片氨基酸分析仪 高等学校化学学报高等学校化学学报 2004, 25: 189~190FMOC FMOC 衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图衍生分离氨基酸的色谱图J Chromatorgr. 1990,499:557FMOCFMOC与与与与CEOCCEOC衍生分离氨基酸的比较衍生分离氨基酸的比较衍生分离氨基酸的比较衍生分离氨基酸的比较Anal. Biochem 2003,313 17~27图3 CEOC 衍生胺类化合物色谱分离图（23种）图2 FMOC 衍生胺类化合物色谱分离图（23种）FMOCFMOC与与与与CEOCCEOC衍生分离脂肪胺的比较衍生分离脂肪胺的比较衍生分离脂肪胺的比较衍生分离脂肪胺的比较II II 醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂 § 羰基氯类： FMOC CEOC§ 磺酰氯类: DNs-Cl§ 卤代三嗪类: EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）CEOC CEOC 衍生醇类荧光检测色谱分离衍生醇类荧光检测色谱分离衍生醇类荧光检测色谱分离衍生醇类荧光检测色谱分离分析化学分析化学 2003, 31, 62~651.苯酚 2.对氯苯酚 3. 2,5-二甲基苯酚 4. 2,4-二氯苯酚 5. 1,4对苯二酚CEOC CEOC 衍生酚类荧光检测色谱分离衍生酚类荧光检测色谱分离衍生酚类荧光检测色谱分离衍生酚类荧光检测色谱分离III III III III 羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂羰基化合物的衍生试剂§ 肼类肼类 DNsDNs-H CEOC-H-H CEOC-H§ 氨基类氨基类 氨基甲基芘氨基甲基芘 肼和胺与肼和胺与肼和胺与肼和胺与羰基化合物的反应羰基化合物的反应羰基化合物的反应羰基化合物的反应1.乳糖 2.甘露糖 3.葡萄糖 4.鼠李糖 5. 山梨糖(FL detection)咔唑咔唑-9--9-乙氧基羰基肼乙氧基羰基肼( (CEOC-H)CEOC-H)柱前衍生中性糖高效液相色谱分离柱前衍生中性糖高效液相色谱分离IV IV 羧酸类化合物的衍生试剂羧酸类化合物的衍生试剂§ 溴甲基类 BrMMC§ 哌嗪基类 DBD-Pz§ 重氮甲烷基类 ADAM§ 其它类 9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)荧光衍生试剂与羧酸的反应荧光衍生试剂与羧酸的反应4-4-氨甲基氨甲基-6,7--6,7-二甲基香豆素二甲基香豆素 ( (ADMC) ADMC) 衍生羧酸衍生羧酸 色谱分离图色谱分离图Anal.Sci.1996,12:189Fig.1 胆汁酸分离色谱图（荧光检测）. 衍生物的激发和发射波长分别为 ex=404, em=440nm9-(2-9-(2-羟乙基羟乙基)-)-吖啶酮吖啶酮 HEA HEA 衍生胆汁酸衍生胆汁酸 色谱分离图色谱分离图V V 分离对映体的手性荧光衍生试剂分离对映体的手性荧光衍生试剂 Toshimasa Toyo’oka JapanJ.C.A 1998 822 215~224 手性荧光衍生试剂手性荧光衍生试剂 R(-)DBD-R(-)DBD-PyNCS PyNCS 衍生分离衍生分离DLDL氨基酸氨基酸OPA OPA 与手性硫醇与手性硫醇 衍生分离衍生分离DLDL氨基酸氨基酸N-异丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC)J.C.A 1999 832 123VI VI VI VI 蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质的衍生的衍生的衍生的衍生试剂试剂试剂试剂目前目前常用常用衍生蛋白衍生蛋白质质的的荧荧光光标记试剂标记试剂有：有：§ 邻邻苯二甲苯二甲醛醛 ( (OPA) OPA) § 4- 4-氟氟-7--7-硝基苯并硝基苯并恶恶二二唑唑 ( (NBD-F)NBD-F)§ 荧荧光素异硫光素异硫氰氰酸酸酯酯 ( (FITC)FITC)§ 3- 3-呋呋喃甲喃甲酰喹酰喹啉啉-2--2-羰醛羰醛 ( (FQ)FQ)邻邻邻邻苯二甲苯二甲苯二甲苯二甲醛醛醛醛 OPA OPA OPA OPA 衍生马心肌红衍生马心肌红衍生马心肌红衍生马心肌红蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质毛细管电泳分离毛细管电泳分离毛细管电泳分离毛细管电泳分离Fig.5 OPA 柱后标记马心肌红蛋白质毛细管电泳图J.Am.Chem.Soc. 1995,117:33253-3-3-3-呋呋呋呋喃甲喃甲喃甲喃甲酰喹酰喹酰喹酰喹啉啉啉啉-2--2--2--2-羰醛羰醛羰醛羰醛 FQ FQ FQ FQ 衍生衍生衍生衍生蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质毛细管电泳分离毛细管电泳分离毛细管电泳分离毛细管电泳分离J.Am.Chem.Soc. 1989,111: 5008VII VII VII VII 核酸核酸核酸核酸的衍生的衍生的衍生的衍生试剂试剂试剂试剂DNA序列分析中所用的四种荧光衍生试剂Nature 1986,327: 674Nature 1986,327: 674DNA DNA DNA DNA 测测测测序序序序仪仪仪仪及及及及电电电电泳泳泳泳图图图图展展展展 望望望望分析化学中的有机分析化学中的有机试剂试剂在分析化学中占有与分析在分析化学中占有与分析仪仪器同等重器同等重要的地位，要的地位，荧荧光衍生化光衍生化试剂则试剂则是有机分析是有机分析试剂试剂的一的一类类重要分重要分支。

支 性能性能优优良的良的荧荧光衍生化光衍生化试剂试剂可能可能将将成成为为某些某些物物质质的高灵敏的高灵敏高高选择选择性分析的关性分析的关键键，，荧荧光衍生光衍生试剂试剂的开的开发发与与应应用用也也正正朝这朝这个个方向方向发发展在在实际实际工作中将可能遇到各种工作中将可能遇到各种现现有有荧荧光衍生光衍生试剂试剂所不能解决所不能解决或不能很好解决的或不能很好解决的问题问题 有必要根据实际工作的需要来开发研究新型的荧光衍生试剂有必要根据实际工作的需要来开发研究新型的荧光衍生试剂Thank You!。