紫檀芪对2型糖尿病大鼠肾脏的影响.docx

    紫檀芪对2型糖尿病大鼠肾脏的影响    刘欣欣 孙华磊 葛惠娜 王腾 李文杰摘 要：目的：研究紫檀芪对2型糖尿病大鼠肾脏的影响方法：采用高糖高脂饮食结合小剂量链脲菌素构建2型糖尿病大鼠模型将大鼠随机分为正常对照组、2型糖尿病组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组干预7w后，检测大鼠血糖和血脂的变化，测定肾功能指标血尿素氮和血肌酐的含量及肾脏氧化应激水平，取肾脏组织做HE染色，观察大鼠肾组织病理学变化结果：2型糖尿病组大鼠血糖、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低;血尿素氮和血肌酐升高;肾脏组织的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）水平升高;肾组织局部可见大量炎性细胞灶性浸润，炎症灶周围肾小管上皮细胞广泛水肿紫檀芪干预后，血糖、TG、TC、LDL-C水平降低;血尿素氮和血肌酐降低;肾脏组织的SOD活性升高，MDA水平下降;肾小球和肾小管病变减轻结论：紫檀芪能够降低血糖和血脂、血尿素氮和血肌酐，改善肾脏的病理损伤，对2型糖尿病大鼠肾脏的损伤具有一定的治疗作用Key：2型糖尿病;紫檀芪;肾脏2型糖尿病占所有糖尿病的比例为93.7%。

中国已成为2型糖尿病患病率增长较快的国家之一，每年大约新增100万2型糖尿病患者预防和控制2型糖尿病及其慢性并发症是世界各国面临的严峻挑战[1-2]紫檀芪（pterostilbene，PTE）是一种广泛存在于天然产物中的二苯乙烯类化合物，主要提取自蓝莓和葡萄籽，有研究证明，紫檀芪为中国珍稀传统中药龙血竭的主要成分之一[3]已有研究表明，紫檀芪具有抗氧化及调节糖、脂代谢异常的作用[4-6]然而紫檀芪对2型糖尿病的肾脏病变是否有影响目前尚未见报道本研究通过对2型糖尿病大鼠进行紫檀芪干预，观察大鼠肾功能相关指标的变化及肾脏的形态学表现，探讨紫檀芪对2型糖尿病大鼠肾脏的影响，为紫檀芪进一步研究及临床应用提供科学依据1 材料与方法1.1 仪器与试剂卓越360全自动生化分析仪，上海科华生物工程股份有限公司;罗氏血糖仪，罗氏诊断产品上海有限公司;甘油三酯测定试剂盒，中生北控生物科技有限公司;总胆固醇测定试剂盒，中生北控生物科技有限公司;高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，中生北控生物科技有限公司;低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，中生北控生物科技有限公司;尿素氮测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;肌酐测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;丙二醛（MDA）测定试剂盒;南京建成生物工程研究所;链脲佐菌素，美国Sigma公司;紫檀芪，上海士丰生物有限公司。

1.2 实验动物及饲料选取SPF级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，由河南省实验动物中心提供，饲养于郑州大学公共卫生学院动物实验中心室温为18～23℃，相对湿度为45%～55%，通风良好，动物分笼饲养，自由饮水摄食，昼夜间隔12h普通饲料，由河南省实验动物中心提供，高脂高糖饲料：59.5%普通粉状饲料、20%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、0.5%胆酸钠1.3 实验方法1.3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立及實验分组 100只4w龄雄性SD大鼠，体重170～220g，适应性喂养1w后，随机选取10只作为正常对照组，给予普通饲料喂养，其余大鼠给予高脂高糖饲料4w后夜间禁食12h，按40mg/kg剂量一次性空腹注射链脲佐菌素STZ溶液，制备2型糖尿病大鼠模型正常对照组大鼠腹腔注射相等体积的柠檬酸钠缓冲液注射STZ72h后，尾静脉采血检测大鼠空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，并且出现多饮、多食、多尿症状即为造模成功[7-8]按上述成膜标准筛选出75只大鼠，造模成功率为83.3%随机选取造模成功的大鼠分为2型糖尿病组、紫檀芪低剂量干预组（20mg/kg）、紫檀芪中剂量干预组（40mg/kg）、紫檀芪高剂量干预组（80mg/kg），各10只，于每日固定时间按照体重计算灌胃剂量进行灌胃1次。

正常对照组和2型糖尿病组于每日固定时间给予羧甲基纤维素钠溶液灌胃1次连续干预7w后，腹腔主动脉取血测定各项生化指标1.3.2 血糖和血脂的测定 采用全自动生化分析仪检测血糖和血脂各项指标，检测方法参照试剂盒说明，空腹血糖（FBG）测定采用葡萄糖氧化酶法，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）测定采用一点终点法，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定采用两点重点法，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定采用过氧化氢酶清除法1.3.3 血尿素氮和血肌酐的检测 干预7w后，采用脲酶法测定血清中尿素氮（SCr）的含量，肌氨酸氧化酶法测定血清中肌酐（BUN）的水平，操作步骤参照试剂盒说明1.3.4 肾脏组织氧化应激水平的测定 血样采集完毕，断头处死大鼠，取出肾脏组织，将部分肾脏组织加入PBS中研磨成10%的组织匀浆，3 000r/min离心10min，取上清，采用Bradford法测定蛋白含量，以黄嘌呤氧化酶法检测SOD 活性，硫代巴比妥酸染色法检测MDA含量，操作步骤参照试剂盒说明1.3.5 肾脏形态学的观察 首先用PBS缓冲液冲洗肾脏组织，然后用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片后于显微镜下观察。

1.3.6 统计学分析 数据采用SPSS 21.0进行统计分析，实验结果以均值±标准差（±s）来表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，组间两两数值比较用LSD法，检验水准为α=0.052 结果与分析2.1 紫檀芪对各组大鼠血糖、血脂的影响前期实验结果[8]表明，干预7w后，与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠FBG、TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量组和中剂量组的FBG降低，具有统计学差异（P<0.05）;紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组TG水平降低，具有统计学差异（P<0.05）;紫檀芪低剂量组和中剂量组大鼠TC、LDL-C水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）紫檀芪低剂量组、中剂量组和高剂量组HDL-C水平与2型糖尿病组比较无统计学差异（表1）2.2 紫檀芪对各组大鼠血尿素氮和血肌酐的影响与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠中血清BUN和SCr值升高，有统计学差异（P<0.05）与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量干预组BUN值降低，紫檀芪低剂量、中剂量组SCr值下降，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3 紫檀芪对各组大鼠肾脏氧化应激水平的影响与正常对照组相比，2型糖尿病组大鼠肾脏组织的SOD活性下降，MDA水平升高，具有统计学差异（P<0.05）与2型糖尿病组相比，紫檀芪低剂量和中剂量干预组的SOD活性升高，MDA水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）2.4 紫檀芪对各组大鼠肾脏形态学的影响如附图所示，正常对照组中大鼠肾组织结构正常，肾小球、肾小管未见明显病变2型糖尿病组中肾组织局部可见大量炎性细胞灶性浸润;炎症灶内肾小管结构模糊或消失;炎症灶周围肾小管上皮细胞广泛水肿，细胞肿胀，胞浆疏松淡染或呈空泡状紫檀芪低剂量干预组中，可见肾小球周围较多炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主;炎症灶内少量肾小管结构模糊;少量肾小管上皮细胞水肿，细胞肿胀，胞浆疏松淡染或呈空泡状紫檀芪中剂量干预组中，可见肾小球及血管周围可见炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主;少量肾小管上皮细胞水肿，细胞肿胀，胞浆疏松淡染;血管肌细胞内多可见呈空泡，将胞核挤压成月牙状紫檀芪高剂量干预组中，可见血管周围极少量炎性细胞浸润，以淋巴細胞为主;极少量肾小管上皮细胞水肿因此，不同剂量的紫檀芪对肾小球和肾小管的病变有不同程度的改善。

3 结论与讨论本课题通过高糖高脂饲料联合小剂量STZ的方式构建2型糖尿病大鼠模型在2型糖尿病大鼠模型诱导成功后，给予不同剂量的紫檀芪进行干预结果发现，紫檀芪能够降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，此结果与文献[5-6]等报道一致糖尿病累及肾小球毛细血管，临床表现为BUN和SCr的增高[9]BUN为蛋白质的分解产物，在人体通过肾小球过滤后随尿液排出体外[10]SCr为肌酸代谢的终末产物，主要经肾小球滤过，在肾小管几乎不被重吸收而流出体外[11]在肾功能正常情况下，BUN和SCr从肾小球滤过，故作为肾小球滤过功能的诊断指标本研究中，2型糖尿病大鼠肾功能受损，肾小球滤过率下降，BUN和SCr升高经紫檀芪干预后，BUN和SCr有所下降，结果提示，紫檀芪可以提高肾小球滤过率高血糖可诱导活性氧簇（ROS）的蓄积并导致氧化应激，当SOD活性降低时，自由基则攻击细胞，导致细胞受损，MDA的含量间接反映组织的氧自由基含量和细胞损伤程度[12]当机体出现氧化与抗氧化系统异常时，其氧化能力显著升高，甚至超越抗氧化能力，进而导致肾脏组织的氧化损伤[13]本研究中，2型糖尿病组大鼠肾脏组织的SOD活性下降，MDA水平升高。

紫檀芪干预后，肾脏组织的SOD活性升高，MDA水平下降因此，应用抗氧化剂紫檀芪干预2型糖尿病可改善机体氧化应激状态，进而减轻氧化损伤，起到改善肾脏功能的作用以往研究很少涉及紫檀芪对2型糖尿病肾脏功能的影响2型糖尿病患者由于机体糖、脂代谢紊乱可以引起肾脏组织等实质性器官的病变，随着机体代谢异常的加剧，肾功能障碍加重，肾脏组织发生的器质性病变能够引发相应的疾病本研究还发现，紫檀芪可以改善2型糖尿病大鼠肾脏的病理变化，减少肾脏的肾小球和肾小管病变，起到缓解和改善肾脏功能的作用本研究发现，紫檀芪在改善2型糖尿病的糖、脂代谢紊乱的同时，也可缓解肾脏组织的病变这可能与紫檀芪多靶点作用有关：紫檀芪可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ），还可以调节氧化应激反应，并能够抑制炎症反应[4]综上所述，紫檀芪可以降低2型糖尿病大鼠的血糖、血脂及BUN、SCr水平，并改善大鼠肾脏的组织形态，提示紫檀芪对2型糖尿病大鼠肾脏的损伤具有一定的治疗作用，以上研究结果为紫檀芪作为天然活性物质在功能食品研制和药品开发方面提供科学依据Reference[1]Kerner W，Bruckel J.Definition，classification and diagnosis of diabetes mellitus[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2014，122（7）：384-386.[2]糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南[J].中国医学前言杂志，2015，7（3）：26-89.[3]Fan LL，Tu PF，Chen HB，et al.Simultaneous quantification of five major constituents in stems of Dracaena plants and related medicinal preparations from China and Vietnam by HPLC-DAD[J].Biomed Chromatogr，2009，23（11）：1191-1200.[4]McCormack D，McFadden D.A review of pterostilbene antioxidant activity and disease modification[J].Oxid Med Cell Longev，2013（2013）：1-15.[5]Pari L，Satheesh MA.Effect of pterostilbene on hepatic key enzymes of glucose metabolism in streptozotocin- and ni。