光学显微镜的历史及基础知识.docx

光学显微镜的历史及基本知识 光学显微镜optical microscope运用光学原理把人眼所不能辨别的微小物体放大成像，以供人们提取微细构造信息的光学仪器简史 早在公元前 1世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观测微小物体时可以使其放大成像后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了结识1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器16前后，意大利的伽利略和德国的J.开普勒在研究望远镜的同步，变化物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路构造，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改善17世纪中叶，英国的R.胡克和荷兰的 A.van列文胡克都对显微镜的发展作出了卓越的奉献1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台这些部件通过不断改善，成为现代显微镜的基本构成部分1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中9台保存至今胡克和列文胡克运用自制的显微镜在动、植物机体微观构造的研究方面获得了杰出的成就19世纪，高质量消色差浸液物镜的浮现使显微镜观测微细构造的能力大为提高1827 年G.B.阿米奇第一种采用浸液物镜。

19世纪70年代，德国人E.阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基本这些都增进了显微镜制造和显微观测技术的迅速发展，并为19世纪后半叶涉及R.科赫、L.巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具在显微镜自身构造发展的同步，显微观测技术也在不断创新：1850年浮现了偏光显微术，1893年浮现了干涉显微术，1935年荷兰物理学家F.泽尔尼克发明了相衬显微术，她为此在1953年被授予诺贝尔物理学奖金古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接受器来观测放大的像后来在显微镜中加入了照相装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接受器现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接受器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和解决系统工作原理表面为曲面的玻璃或其她透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像光学显微镜就是运用这一原理把微小物体放大到人眼足以观测的尺寸近代的光学显微镜一般采用两级放大，分别由物镜和目镜完毕被观测物体AB位于物镜的前方,被物镜作第一级放大后成一倒立的实象A1B1然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象A2B2,人眼看到的就是虚像A2B2。

显微镜的总放大倍率为显微镜总放大倍率＝物镜放大倍率×目镜放大倍率放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比在用人眼直接观测的显微镜中,可以在实像面A1B1处放置一块薄型平板玻璃片，其上刻有某种图案的线条，例如十字线当实像A1B1和这些刻线叠合在一起时,运用这些刻线就能对物体进行瞄准定位或尺寸测量这种放置在实像面处的薄型平板玻璃片通称分划板在新型的以光电元件作为接受器的光学显微镜中，电视摄象管的靶面或其她光电元件的接受面就设立在实像面上构成 光学显微镜由载物台、聚光照明系统、物镜、目镜和调焦机构构成载物台 用于承放被观测的物体运用调焦旋钮可以驱动调焦机构使载物台作粗调和微调的升降运动，使被观测物体调焦清晰成象它的上层可以在水平面内沿、方向作精密移动和在水平面内转动，把被观测的部位调放到视场中心聚光照明系统 由灯源和聚光镜构成当被观测物体自身不发光时，由外界光源给以照明照明灯的光谱特性必须与显微镜的接受器的工作波段相适应聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观测的部位物镜位于被观测物体附近实现第一级放大的镜头在物镜转换器上同步装着几种不同放大倍率的物镜转动转换器可让不同倍率的物镜进入工作光路物镜放大倍率一般为5～100倍。

物方视场直径（即通过显微镜能看到的图像范畴）约为 11-20毫米物镜放大倍率越高则视场越小物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件常用的有：①能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；②质量更高的能对三种色光校正色差的复消色差物镜；③能保证物镜的整个像面为平面以提高视场边沿成像质量的平像场物镜为了提高显微观测的辨别率，在高倍物镜中采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体目镜位于人眼附近实现第二级放大的镜头目镜放大倍率一般为5～20倍，按能否放置分划板,可提成两类：①不适宜放置分划板的，如惠更斯型目镜这是现代显微镜中常用的型式，长处是构造简朴、价格低廉；缺陷是由于成像质量的因素，不适宜放置供瞄准定位或尺寸测量用的分划板②能放置分划板的，如凯尔纳型和对称型目镜，它们能克服上述目镜的缺陷按照能看到的视场大小，目镜又分为视场较小的一般目镜和视场较大的大视场目镜（或称广角目镜）两类调焦机构 载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，获得清晰的图像用高倍物镜工作时，容许的调焦范畴往往不不小于微米，因此显微镜必须具有极为精密的微动调焦机构。

显微镜放大倍率的极限 显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率仪器的辨别率是指仪器提供被测对像微细构造信息的能力辨别率越高则提供的信息越细致显微镜的辨别率是指能被显微镜清晰辨别的两个物点的最小间距根据衍射理论，显微物镜的辨别率为sigma=0.61lamda/N.sinU ~1式中lamda为所用光波的波长；N 为物体所在空间的折射率，物体在空气中时N=1；U为孔径角，即从物点发出能进入物镜成像的光线锥的锥顶角的半角;NsinU 称为数值孔径当波长λ一定期，辨别率取决于数值孔径的大小数值孔径越大则能辨别的构造越细，即辨别率越高数值孔径是显微物镜的一种重要性能指标，一般与放大倍率一起标注在物镜镜筒外壳上，例如40×0.65表达物镜的放大倍率为40倍，数值孔径为0.65辨别率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念当选用的物镜数值孔径不够大，即辨别率不够高时，显微镜不能分清物体的微细构造，此时虽然过度地增大放大倍率，得到的也只能是一种轮廓虽大但细节不清的图像这种过度的放大倍率称为无效放大倍率反之如果辨别率已满足规定而放大倍率局限性，则显微镜虽已具有辨别的潜在能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。

为了充足发挥显微镜的辨别能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配，以满足下列条件：500NsinU＜显微镜总放大倍率＜1000NsinU ~2在此范畴内的放大倍率称为有效放大倍率由于sinU永远不不小于1，物方空间折射率N最高约为1.5，NsinU不也许不小于1.5，故光学显微镜的辨别率受 (1)式限制，具有一定的极限有效放大倍率受上式限制,一般不超过1500倍显微镜使用者应由所需辨别的最小尺寸按(1)式拟定所需的数值孔径，选定物镜,然后按(2)式选定总放大倍率和目镜放大倍率提高辨别率的途径是：采用较短波长的光波或增大孔径角U值，或是提高物体所在空间的折射率N，例如在物体所在空间填充折射率为 1.5的液体以这种方式工作的物镜称为浸液物镜而电子显微镜正是运用波长极短的特性，在提高辨别率方面获得重大突破的聚光照明系统对显微观测的影响 聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又易于被使用者忽视的环节它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明聚光镜发来的光束应能保证布满物镜孔径角，否则就不能充足运用物镜所能达到的最高辨别率为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。

观测高反差物体时，宜使照明光束布满物镜的全孔径；对于低反差物体,宜使照明光束布满物镜的2/3孔径在较完善的柯勒照明系统中，除可变孔径光阑外，还装有控制被照明视场大小的可变视场光阑，以保证被照明的物面范畴与物镜所需的视场匹配物面被照明的范畴太小固然不行，过大则不仅多余，甚至有害，由于有效视场以外的多余的光线会在光学零件表面和镜筒内壁多次反射，最后作为杂散光达到像面，使图像的反差下降 变化照明方式，可以获得亮背景上的暗物点（称亮视场照明）和暗背景上的亮物点（称暗视场照明）等不同的观测方式，以便在不同状况下更好地发现和观测微细构造分类 光学显微镜有多种分类措施：①按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；②按图像与否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；③按观测对像可分为生物和金相显微镜等；④按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；⑤按光源类型可分为一般光、荧光、红外光和激光显微镜等；⑥按接受器类型可分为目视、照相和电视显微镜等常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等双目体视显微镜运用双通道光路为左右两眼提供一种具有立体感的图像它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相称于人们用双目观测一种物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。

双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作金相显微镜专门用于观测金属和矿物等不透明物体的金相组织的显微镜这些不透明物体无法在一般的透射光显微镜中观测，故金相和一般显微镜的重要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观测物体表面，被物面反射后再返回物镜成像这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作偏光显微镜用偏振光对物体进行观测的显微镜它的工作原理是在一般显微镜的照明光路中加入起偏器，使照到物面上的照明光束变成具有单一偏振方向的偏振光在物镜和目镜之间的成像光路中加入检偏器，它的偏振方向与起偏器的偏振方向互成90°如果被观物体不变化入射照明光束的偏振状态，则出射光便被检偏器完全阻挡，不能形成图像；如果被观物体变化入射光的偏振状态,则有一部分光通过检偏器,提供某些本来在非偏振光中发现不了的图像信息偏光显微镜在地质、生物、材料工程等领域中用于观测晶体双折射、晶轴方向和偏振面旋转紫外荧光显微镜 用紫外光激发荧光来进行观测的显微镜某些标本在可见光中察觉不到构造细节，但通过染色解决，以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图像。

此类显微镜常用于生物学和医学中相衬显微镜和微差干涉对比显微镜运用相位差和干涉原理来提高观测效果的显微镜在一般显微镜中，图像的对比度是由于物体各部位对光的吸取率不等而导致的但在某些细胞组织和金属构造中，各部位的吸取率差别太小，以致不能形成可察觉的对比度对于此类物体往往需要进行染色解决（对细胞组织）或酸腐蚀解决(对金属)以导致可见的对比差别而这些解决过程也许引入人为的假像，从而歪曲原有特性的真实性相衬法和微差干涉对比法就是为了避免这些缺陷而发展起来的当光波通过吸取率相等或相近的各个部位时，吸取率也许没有差别，但通过各部位的光程差也许不等相衬法和微差干涉对比法运用干涉效应把一般状况下人眼不可见的光程差转换成可见的亮暗差，形成可见的构造对比图像此类显微镜广泛用于金属学、医学和集成电路制备工艺中红外显微镜 用红外光源照明和成像的显微镜在显微镜的实像面处装入红外变像管，把不可见的红外图像转换成可见图像运用某些物体对红外光的透射或反射特性来观测在可见光中察觉不到的构造此类显微镜用于赝品鉴别、硅晶片表面缺陷检测等电视显微镜和电荷耦合器显微镜以电视摄像靶或电荷耦合器作为接受元件的显微镜在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接受器，通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。

此类显微镜的重要长处是与计算机联用后便于实现检测和信息解决的自动化，应用于需要进行大量繁琐的检测工作的场合扫描显微镜成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜显微镜使用者所。