微生物学课件2.2.ppt

第三节 细菌形态与结构检查法【【教学内容教学内容】】细菌的显微镜放大法和染色检查法法 【教学要求】 ￿￿ 掌握： ￿￿ 细菌的染色检查法了解： ￿￿ 细菌的显微镜放大法 【教学重难点】 ￿￿ 重点：细菌的染色检查法 ￿￿难点：细菌的染色检查法 【教学时数】：2学时 【教学方法】：讲授法为主，演示法为辅• 显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能 直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜 、电子显微镜）放大后才能观察• 染色检查法——细菌体小,半透明，经染色后 才能观察较清楚普通光学显微镜的分辨率为0.25um一般细菌都大于 0.25um，故可用普通光学显微镜观察１、普通光学显微镜(light microscope)一、显微镜放大法电子显微镜的分辨率为1nm不仅能看清细菌的外形， 内部超微结构可一览无余２、电子显微镜(electron microscope)肺炎链球菌荚膜荚膜一、显微镜放大法3、透射电 镜4、扫描电 镜二、染色检查法由于细菌细胞微小又透明，一般先要经过染色才能作显微观察革兰氏染色法细菌染色鉴别染色法简单染色法负染色：正染色死菌活菌抗酸性染色法芽孢染色法姬姆萨染色法荚膜染色法用美蓝或TTC等作活菌染色（一）单染色法• 1、原理 • 细菌的体积小，五色半透明，在普通光学显 微镜下不易观察清楚，通常需染色来增加菌体与 背景之间的色差，这比不染色标本清楚易辨。

• 由于细菌的等电点为pH2～5，在接近中性的环 境中通常带负电荷，易与带正电荷的碱性染料相 结合而染上颜色，故常用亚甲蓝、碱性复红、草 酸铵结晶紫等染料染色单染法只使用一种染料 ，所染的细菌均被染成一种颜色，一般能够显示 细菌的形态、排列和大小，但不能显示细菌的内 部构造• ２、常用染料和器具 • • 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌18～24h培 养物，生理盐水，亚甲蓝染色液，碱性复 红染液，香柏油，二甲苯，显微镜，接种 环，吸水纸，载玻片，酒精灯，擦镜纸３、方法• （1）涂片 • 取洁净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于 载玻片中央(如被检材料是液体，可不加生理盐水 )将接种环在酒精灯火焰上灭菌，冷却后，伸人 被检菌试管取菌少许(切不可多，更不可将培养基 刮下)，混入载玻片上的生理盐水中，磨匀并涂抹 成直径1．5cm左右的均匀薄层菌膜将接种环灭 菌后放回原处 • （2）干燥 • 涂片最好在室温中让其自然干燥有时为了干 燥得快些也可在酒精灯火焰上方烘干，但勿紧靠 火焰；也可以用吹风机吹干 • ３、方法 • （3）固定 • 让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层来回通过3 次，此为“固定”。

目的是使细胞质凝固，以固定细菌的形 态，并使细菌粘附于玻片上，染色和水冲时不会脱落 • （ 4）染色 • 将细菌涂片平置，滴加1滴亚甲蓝(或复红染液)于菌膜 上，染液以覆盖涂抹的标本为度，染色1—2min • （ 5）水洗 • 斜置载玻片，用细水流从上端流下洗去多余的染液 • （ 6）干燥 • 自然干燥或用吹风机吹干水分 • （7）镜检 • 先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，再于标 本上滴上一滴香柏油，置于油镜下进行观察 • • ４、注意事项 • （1）固定时温度不可过高，以载玻 片反面触及皮肤时热而不烫为宜 • （2）水洗时，不要对着标本直接冲 洗，以免冲去被检标本，一般以冲洗 下来的水基本无色为度 • （3）染色完毕，倾去水分，于室温 中自然干燥，不可在标本上擦试，以 免擦损标本 • • （二）革兰染色法：• C.Gram（革兰）于1884 • 年发明的一种鉴别不同类 • 型细菌的染色方法二、染色检查法（二）革兰染色法１、染色步骤（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30 ~ 60S）ABBBABAA（1）初染（结晶紫30S）革兰氏染色程序和结果（1）初染（结晶紫30S） （2）媒染剂（碘液30S） （3）脱色（95%乙醇10~20S） （4）复染（蕃红30 ~ 60S）ABBBABAA革 兰 氏 染 色 程 序 和 结 果（2）媒染剂（碘液30S）（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S） （3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30 ~ 60S）ABBBABAA革 兰 氏 染 色 程 序 和 结 果（3）脱色（95%乙醇10~20S）（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S） （3）脱色（95%乙醇10-20S）（4）复染（蕃红30 ~ 60S）ABBBA BAA革 兰 氏 染 色 程 序 和 结 果（4）复染（蕃红30 ~ 60S） A：革兰氏阳性细菌G+B：革兰氏 阴性细菌G﹣为什么？（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S） （3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30 ~ 60S）２、染色原理• 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 • 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细 胞壁阻留在细胞内。

• 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的 反应 • G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱 色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被 阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色 • Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收 缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘 复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复 染后呈红色３、结果判断• 菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+） • 菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）阳性菌阴性菌革兰阳性 革兰阴性４、注意事项• （1）载玻片要洁净无油 • （2）涂片以匀薄为佳，切不可浓厚过于密集的 菌体，因洗脱不匀常呈假阳性 • （3）要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精 脱色，时间过短，革兰阴性菌可染成紫色造成假 阳性；反之，脱色时间过长，革兰阳性菌也可被 染成红色造成假阴性 • （4）碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存 如因储存不当，试液由原来的红棕色 • 变成淡黄色，则不宜再用本次课作业• １．细菌染色前，为什么必须固定? • ２．为什么滴加香柏油镜检前要干燥? • ３．哪些条件影响革兰染色效果?其关键步骤是什 么? • ４．革兰染色法有何实际意义? • ５．比较单染法与复染法的优、缺点。

• ６．在细菌的结构中与革兰氏染色有关的结构是 ： • A、中介体；B、核质；C、细胞膜；D、细胞壁。