Weibel-Palade小体形和功能研究进展.docx

          Weibel-Palade小体形和功能研究进展                    内皮细胞在止血、炎症、血管生成和伤口愈合等多种生理反应中起重要作用，而这些功能的实现依赖于分泌性细胞器WPB (Weibel-Palade body)在受到刺激时能够快速释放其中的生物活性分子含有溶酶体相关膜蛋白(Lysosome-associated membraneproteins，LAMPs)、细胞器腔内酸性pH值以及成熟过程中AP-3依赖性物质运输机制【1】，都提示WPB属于溶酶体相关细胞器(Lysosome-related organelles，LRO)本文主要讨论有关WPB形成和功能，以及vWF(von Willebrand factor)等主要生物活性分子的结构与功能1 WPB结构与组成特点早在1 964年，Weibel和Palade[2]就在血管内皮细胞和心内膜细胞中发现这种长约1—6 um的棒状细胞器1982年，Wagner等[31应用透射电子显微镜观察到WPB呈现规则的与长轴平行的管状结构，这些管状结构就是vWF分子的多聚体形式与以往化学固定不同，应用高压冷冻和冷冻置换(High-pressure freezing and freeze substitution,HPF/FS)固定方法[4】，在电子显微镜下可以观察到WPB膜结构与内部vWF管状结构更复杂的相互关系，划分出不同成熟阶段的WPB，包括(1)由高尔基体反式面网络(Trans-Golgi network，TGN)新生且尚未完全脱离的；(2)核周未成熟的和(3)靠近质膜成熟的等不同亚类。

未成熟WPB仍然附着在高尔基体或是已脱离但还停留在核周这类WPB电子密度低，而且内部的vWF管状结构也不够规则，除了vWF分子末端之外，膜不直接与vWF接触但是，vWF分子之间以及vWF与WPB膜之间的分布有一定规律性，提示膜和小管、小管与小管之间或者两者与WPB内其他分子之间应该存在某种相互吸引或排斥的作用，以保持WPB形态核周成熟的WPB电子密度高，管状结构排列规则，WPB的横径也由最初约222 nm压缩至151 nm除了成熟过程中vWF进一步的聚合压缩外，相继招募其他分子也会增加其电子密度结合动态观察，发现WPB在形态上也不是单一的棒状，可见“L’’或“Y”形态用电子断层扫描[5]可以确认这些形状不规则的WPB并不是相互重叠所致通常WPB只有一个折点，具体原因不明，可能是该位置vWF中断，这一特点或许与其在细胞中运动有关除此之外，还有部分不规则WPB显示两个或两个以上未成熟WPB的融合过程vWF是WPB的主要成分[3】，黏附聚集血小板和Ⅷ因子(FⅧ)参与初级与次级凝血反应vWF缺失或结构异常会导致血管性血友病(von Willebrand dis-ease，vWD)[6]同时血浆中vWF含量过高与急性冠心病、缺血性中风和外周性血管疾病有关[7]。

在非内皮细胞内(HEK293，AtT20等)表达vWF可以诱导形成WPB样细胞器‘8-0]，说明vWF在WPB形成过程中起重要作用vWF单体是一个多结构域的大分子糖蛋白，前体350 kDa，包括一个22个氨基酸残基的信号肽(N)，741个氨基酸残基的肽原(Dl-D2)和2050个氨基酸残基的成熟蛋白(D’．D3．…一CK)，其中多个结构域分别与FⅧ、血小板和胶原等生物活性分子结合，D’一D3和CK结构域富含半胱氨酸残基，与vWF多聚化有关随后在内质网(Endoplasmic reticulum，ER)中，两个单体在C端富含半胱氨酸的结构域形成二硫键而二聚体化，二聚体内N端的肽原分别与各自单体内的D3结构域形成分子内的二硫键当蛋白被转运至TGN时，二聚体内肽原和D3结构域之间的二硫键打开，使得不同二聚体D3．结构域之间形成二硫键，从而vWF聚合成为一个约20 000 kDa的大分子蛋白弗林蛋白酶(Furin)可破坏肽原与成熟肽之间的共价结合[11]，但两者仍在酸性pH和高钙离子浓度条件下以1:1非共价结合[12,13】，也正是这种作用，促使vWF在WPB内呈现的管状结构【14]除了WPB内贮存的高度聚合的vWF外，还有一部分小分子量vWF会被持续地释放至胞外。

而WPB内贮存的vWF只有在受到外界刺激时才会被释放至血管内，进一步串联成几毫米长的蛋白分子并聚集血小板形成血凝块，同时还能和胶原、肝素、FⅧ等结合，参与初级和次级凝血反应【5,16】vWF的多聚化程度对凝血功能非常重要聚合程度低导致凝血障碍即血管性血友病，聚合度过高则可能引发血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thrombocyto-penia purpura，rTP)[17】TTP是一种致命的血小板疾病，血小板不断凝集到血栓块中，阻滞血栓纤溶，导致微血管闭塞【18】血管内皮细胞释放vWF参与血小板凝集的初级凝血过程中，多聚化程度是必需的，虽然还没有直接证据证明这一点随着研究的深入，发现WPB中还存在其他生物活性分子，大致可以分为膜蛋白和分泌蛋白两类【19】其中包括白细胞趋化因子P．选择素(P_selectin)[20]、溶酶体标志蛋白CD63[20]、小G蛋白酶Rab27A和Rab3D[21,2 2】、al、3一岩藻糖基转移酶Ⅵ【23】、骨保护素【24】等等但是这些分子是如何进入WPB，以及它们在WPB中发挥怎样的功能，迄今并不完全清楚，下面将进行讨论2 WPB的发生与成熟过程在HEK293细胞、AtT20或犬主动脉内皮细胞中，表达全长vWF可以形成WPB样细胞器，也能招募膜蛋白，在刺激后分泌释放。

可见vWF自我组装对于WPB的形成至关重要，这与神经内分泌小泡的成熟过程相似【25]然而单转染vWF成熟肽或者肽原，细胞内不形成WPB样细胞器l26]但是，在细胞中共表达肽原与缺失CK结构域的成熟肽，虽然不能形成C末端的二硫键而只能形成N末端的二硫键，仍能形成WPB样细胞器【27】与前面提到的弗林蛋白酶不同，莫能素(Monensin)破坏肽原与成熟肽之间非共价结合【28】，虽不影响已经形成的分子间二硫键，但影响管状结构的形成，致使WPB从长杆状变为球状而二硫苏糖醇(DTT)可破坏vWF分子间二硫键，却不会影响WPB形态，表明其管状结构的形成与肽原和成熟肽的非共价结合密切相关[27]因此，WPB的形成似乎并不依赖于vWF的高度聚合，而是需要肽原与成熟肽之间非共价作用下形成的管状结构利用HPF/FS也观察到vWF最先在TGN剪切肽原，并在局部酸性环境下产生管状结构因此，管状结构形成可能在WPB发生早期对于长杆状结构的形成发挥作用但是这种高度聚合的管状结构是如何由二聚体组装起来，还需进一步研究2.1 AP-l/Clathrin在WPB发生过程中的作用AP-l/Clathrin在高尔基反式面形成囊泡运输蛋白【29】，在TGN为WPB发生提供膜结构性支架功能【30】。

EM和免疫荧光显示核周的未成熟WPB均被包被，siRNA干扰AP-1以及AP180功能缺失均能抑制WPB的形成和功能性释放WPB的杆状形成需要vWF的管状结构，提示vWF管状结构最初形成需要AP-l/clathrin的参与而经布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)处理，释放所有AP-I/clathrin后，并不会改变已形成的WPB的形态说明一旦WPB形成，这种形态的维持就不再需要AP- l/clathrin然而胰腺p细胞中表达clathrin中心结构域功能缺失的载体，并不影响胰岛素的贮存和分泌【31】，说明AP-l/clathrin参与WPB形成的方式，不同于其他传统意义上的分泌小泡的作用事实上，WPB其他内容物可能也与AP- l/clathrin有相互作用，但这些可溶性蛋白是如何被膜外侧的蛋白复合物招募的还不清楚在内分泌或者神经内分泌小泡成熟过程中【32】，AP一l/clathrin还会移除某些分子，在WPB成熟过程中是否也有类似功能还有待进一步研究，毕竟成熟WPB不被AP- l/clathrin被覆未成熟WPB上观察到AP-1效应因子Aftiphilin和y-synergin【33】，可能是被AP-1招募过去。

分别在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells．HUVEC)中敲降这两个效应分子，得到相似的结果【34】，能生成杆状WPB，并正常招募其他蛋白分子，但是其释放发生改变敲降AP-I的另一效应因子P200的两个亚型p200a和p200b，并没有观察到类似结果有可能P200不参与WPB的分泌调节，也有可能因为敲降的效率不足以观察到表型的改变值得注意的是，AP-1和效应因子虽然只存在于未成熟的WPB，却影响WPB的分泌，可能因为分泌小泡发生或成熟过程的异常会导致分泌障碍‘35】尽管没有明确的分子机制，推测Aftiphilin和´y-synergin会招募某种调节分泌所需的因子或者清除某种抑制分泌的因子2.2 WPB在TGN招募的蛋白分子WPB的一些组分，如分泌性蛋白血管生成素-2、嗜酸细胞活化趋化因子、骨保护素以及膜蛋白白细胞受体P-选择素，都是在TGN当WPB发生时被招募的而CD63、Rab27A和Rab3D是在WPB脱离TGN后相继被招募的，这与电子密度的增加相～致骨保护素在TGN合成后通过与vWF的直接相互作用进入WPB[361，FⅧ进入WPB似乎并不是由于直接作用【37】，因为在vWF与FⅧ结合能力不同程度缺陷的突变体，FⅧ都能进入WPB，但是却发生WPB的形态改变，或许是两者的相互作用对WPB形态有影响。

其他分泌性蛋白如何进入WPB还有待进一步阐明膜蛋白P．选择素的运输更为复杂，因为TGN新合成和质膜上内吞的P一选择素【38】都可以被招募到WPBP一选择素分子是一次跨膜蛋白，其胞浆尾有两个结构域与内吞密切相关：KCPL结构域介导从初级内涵体到晚期内涵体的转运，YGVF结构域介导从内涵体到TGN的转运【20]一旦P一选择素到达TGN，就可以通过细胞器内部结构域与vWF D’-D3结构域的直接作用被招募到WPB【39]，并且只表达P．选择素细胞器内部的结构域就足以使这些截短分子进入WPB但是，P一选择素细胞器内部结构域被辣根过氧化物酶置换的融合蛋白，仍然可以招募到WPB，这可能是因为胞质尾端可以通过内吞通路回到TGN，并通过间接作用进入WPB，但是后者的速度明显降低P一选择素进入WPB也是AP-1依赖性的，在AP-1缺失的内皮细胞中，vWF阳性小分泌泡中检测不到P．选择素【30】可以看出P一选择素的丢失和WPB形态发生障碍相关，可能是因为vWF形成管状结构时需要结合P．选择素2.3 WPB脱离TGN后的内容物的招募与上面提到的分子不同，有些分子被转运到脱离TGN的WPB例如依赖AP-3转运的CD63。

CD63属于四次跨膜蛋白家族，这类蛋白与细胞黏附因子、各种免疫球蛋白超家族成员等相互作用，可能与早期内皮炎症应答有关然而，缺失CD63的功能影响迄今为止还不清楚AP-3是参与由早期内涵体到溶酶体或溶酶体相关细胞器的转运的一种复合体【40,4’】CD63表达广泛，在晚期内涵体、溶酶体和造血细胞分泌性溶酶体中均有表达在血管内皮细胞也普遍表达在晚期内涵体／溶酶体以及WPB膜上，AP-3缺失后，CD63只定位在前者，而不能在WPB表达[20】，表明AP-3在WPB的分子定向运输中的重要性在WPB成熟过程中还需要招募小GTP酶Rab27A分子Rab27A存在于多种溶酶体相关细胞器中【42】，这些细胞器又被称为分泌溶酶体，在不同细胞中特异性表达[43】Rab27A也存在于经典分泌颗粒，参与分泌活动[44】它通过许多不同的效应分子来控制细胞器的功能，包括他们的转运和释放在WPB。