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年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计论文 定稿 年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计目录引言 - 2 -1菌种的选育 - 3 -1.1材料与方法 - 4 -1.1.1出发菌株 - 4 -1.1.2 培养基与培养条件 - 4 -1.1.3发酵效价测定 - 5 -1.1.4诱变处理 - 5 -1.1.5豆油耐性变种的选育 - 5 -1.1.6缬氨酸诱导变种的选育 - 5 -1.2 预计结果 - 5 -1.2.1豆油耐性变种的选育 - 5 -1.2.2缬氨酸诱导变种的筛选 - 6 -1.2.3菌株 XC 4-18的遗传稳定性 - 6 -1.2.4菌株 XC 4-18与菌株XC 1-19的生产水平比 - 6 -1.3原因分析 - 6 -2种子的扩大化培养 - 6 -2.1孢子制备 - 7 -2.2种子制备 - 7 -2.3种子培养 - 7 -2.4种子质量的控制 - 8 -2.5种子质量的控制措施 - 8 -3培养基的设计 - 8 -3.1碳源 - 9 -3.2氮源 - 9 -3.3无机盐和微量元素 - 9 -3.4生长因子 - 10 -3.5水 - 10 -3.5前体物 - 10 -4灭菌 - 10 -4.1连续灭菌流程及设备 - 11 -4.1.1流程的选择 - 11 -4.2连续灭菌的操作 - 12 -4.3连续灭菌的计算 - 13 -5空气除菌 - 14 -5.1空气预处理与设备 - 15 -5.2油水分离与设备 - 15 -5.3生产规模设置 - 16 -6发酵过程中的控制参数 - 17 -6.1发酵主要操作方式 - 17 -6.2发酵过程中的代谢变化参数 - 18 -6.2.1物理参数 - 18 -6.2.2 化学参数 - 19 -6.2.3生物参数 - 20 -6.2.4发酵终点的判断 - 20 -7相关计算 - 21 -7.1发酵罐的工艺尺寸 - 21 -8下游加工 - 23 -8.1发酵液预处理 - 24 -8.2过滤 - 24 -8.3醋酸丁酯提取 - 24 -8.4水洗 - 25 -8.5水提 - 25 -8.6脱丁酯 - 25 -8.7结晶 - 25 -8.8产品检测 - 26 -8.9干燥包装 - 26 -参考文献 - 26 -年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计引言 螺旋霉素,英文名Spiramycin。

白色或微黄色粉末,微有味;微吸湿;易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇,难溶于水具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应(PAE),能够增强吞噬细胞的吞噬作用,广泛分布于体内本品在组织细胞内浓度较红霉素高,而副作用小于红霉素可用于治疗由革兰阳性菌和某些革兰阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染该品系多组分大环内酯类抗生素,作用机制、抗菌谱与红霉素相似,抗 肺组织菌作用与红霉素相似或略逊,但比其具有更长的抗生素后效应(PAE)与红霉素有交叉耐药对革兰阳性菌和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效对立克次体等有效 在抗感染药物市场中,大环内酯类抗生素和头孢菌素类、喹诺酮类、青霉素类一起,成为四大主力军团而螺旋霉素及其衍生物长期以来一直占据35%左右的大环内酯类抗生素市场份额,正处于销售成熟期全国有螺旋霉素及其衍生物的制剂生产企业近100家,有稳固的市场,有固定的销售渠道,有叫得响的品牌,有价格低廉的优势,相信今后市场销售额还会稳步上升 后市发展潜力巨大:目前,我国仍为发展中国家,13亿人口的人均年用药金额不到10美元,与发达国家60美元~100美元的用药水平相比差距很大。

今后,随着人民生活水平的逐步提高,医疗保障体系的日趋完善,对药品的总体需求还将不断扩大,医药市场这个蛋糕必将越做越大,螺旋霉素及其衍生物市场销售额也必定水涨船高1菌种的选育 螺旋霉素的产生菌是生二素链霉菌S.azmbo-faeiensis,在合成培养基上气生菌丝生长快,白转灰色,基内菌丝为微黄色至微灰色,可溶色素淡黄褐色孢子丝长,螺旋霉素形,松紧不一,孢子卵圆至球形国产链霉菌新品种L799,其孢子长方形,孢子表面有疣状凸起并带有粗短小刺在大多数培养基上产生菌丝淡紫灰,基内菌丝呈葡萄紫其孢子形成慢且不易保藏,因此要选择适宜的保藏方法和条件,以保证孢子的存活率 菌种选择:本设计采用的是中国微生物资源库菌种保藏中心的产二素链霉菌链霉,在实验室其发酵效价可达到1500~3000u/mL 根据螺旋霉素的生物合成途径对螺旋霉素产生菌产二素链霉菌进行推理选育, 并获得了高产菌株首先在紫外线诱变的基础上,筛选豆油耐性变株得到菌株 XC 2-37, 其发酵效价较出发菌株XC 1-29提高9%通过培养基优化, 菌株 XC 2-37 的发酵效价提高61.8% 再以紫外线处理菌株 XC2-37,并筛选缬氨酸诱导变株, 得到菌株 XC 3-11,其发酵效价较菌株 XC 2-37提高20%。

菌株 XC 3-11经自然分 离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到 4500u/ml,为原始出发菌株 XC 1-29 的 2. 25 倍传代试验表明菌株XC 4-18的高产遗传特性稳定菌株XC 4-18应用于50m3发酵罐进行工业化生产,与原始出发菌株XC 1-29相比,发酵效价和发酵指数分别提高84.9%和43.6% 螺旋霉素 spiramycin, SPM 为十六元大环内酯类抗生素,其内酯环的生物合成是由5分子乙酸、1 分子丙酸、1分子丁酸和1分子未知前体二碳单位组成支链氨基酸,如缬氨酸等,经分解代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸, 作为 SPM 生物合成的前体现根据SPM生物合成途径对SPM产生菌产二素链霉菌进行推理选育,并获得了高产菌种 产二素链霉菌 Strep tomy cesam bofaciens XC 1-29 1.1.2 培养基与培养条件 斜面培养基:含淀粉,豆饼粉,MgSO4,NaCl,CaCO3 ,琼脂; 以温度28±℃,相对湿度30%-50%,培养12d 平板培养基:含淀粉, KNO3,K2HPO4,MgSO4 ,NaCl,FeSO4,琼脂;培养条件同斜面(以温度28±℃,相对湿度30%-50%,培养12d。

) 种子培养基:含淀粉,豆饼粉,蛋白胨,玉米浆,KH2PO4,NaCl,CaCO3;以温度 28±℃,220r/min 培养40h 发酵培养基:含淀粉,葡萄糖,玉米浆鱼粉,酵母粉,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,NaCl,CaCO3,豆油;以温度 28±℃,接种量8% ,220r/min 培养96h 1.1.3发酵效价测定 杯碟法,检定菌为藤黄八叠球菌28001 将产二素链霉菌 XC 1-29 新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液,吸取5ml于无菌平板中置于波长253.7nm,功率30W,紫外灯之下30m处,开盖,震荡照射60s 用豆油代替分离培养基中的淀粉, 将诱变存活孢子涂布于这一培养基上, 筛选豆油耐性变株Oil 将诱变存活孢子涂布在含L-缬氨酸分离培养基中, 筛得缬氨酸诱导变种 Val 1.2 预计结果 产二素链霉菌 XC1-29 经UV诱变后的存活孢子,适当稀释后涂布于含豆油的平板培养基上,UV诱变和不诱变孢子也分别稀释涂于不含豆油的平板培养基上作对照以上3组各挑一定量菌落移种斜面,经二级发酵后测定效价,比较SPM 生产能力 结果表明:豆油耐性变株的发酵效价高于自然分离株与UV诱变株其中豆油耐性突变株XC 2-37 的发酵效价较出发菌株 XC 1-29提高9%。

通过培养基优化,菌株XC 2-37的发酵效价又提高6.8%. 以菌株 XC 2-37 为出发菌株,通过UV诱变处理,并在含L-缬氨酸的平板培养基上筛选缬氨酸诱导变种,UV诱变和未诱变菌株作对照 结果表明:缬氨酸诱导变株的发酵效价高于自然分离株与紫外诱变株 其中缬氨酸诱导变株 XC 3-11的发酵效价较出发菌株 XC 2-37 提高20% 菌株 XC 3-11 经自然分离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到4500u/ml,比菌株 XC 3-11 提高6.7% 菌株XC 4-18 的发酵效价是原始出发菌株的2.25倍 1.2.3菌株 XC 4-18的遗传稳定性 用群体连续传代的方法考察菌株 XC4-18 的传代稳定性,其生产能力波动幅度小, 说明菌株 XC 4-18的高产遗传特性稳定 1.2.4菌株 XC 4-18与菌株XC 1-19的生产水平比 菌株XC 4-18 与菌株XC 1-29应用于50m3发酵罐的生产菌株XC 4-18 的发酵效价和发酵指数分别较出发菌株XC 1-29提高84.9%和43.6% 螺旋霉素为大环内酯类抗生素,其内酯环由五个乙酸,一个丙酸,一个丁酸和一个未知前体构成。

在发酵培养基中加入短链脂肪酸能刺激产二素链霉菌SPM的生物合成都有分解能产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸, 豆油耐性变种能提高菌株利用脂肪酸的能力, 因此能提高SPM产量 缬氨酸等氨基酸代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸,能刺激SPM的生物合成 缬氨酸诱导变种能多产前体,导致SPM 增产2种子的扩大化培养 工业生产规模越大,每次发酵所需的种子就越多要使小小的微生物在几十小时的较短时间内,完成如此巨大的发酵转化任务,那就必须具备数量巨大的微 生物细胞才行菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子种子扩大培养的任务,不但要得到纯而壮的菌体而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体 的种子制备一般包括两个过程,即在 固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培 养基中生产大量菌丝的种子制备过程 养基中生产大量菌丝的种子制备过程 孢子制备是种子制备的开始,是发酵生产的一个重要环节孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点 霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、 麸皮、麦粒等天然农产品为培养基这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。

霉菌的培养一般为25~28℃,培养时间为4~ 14天 2.2种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养,使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程 ⑴ 摇瓶种子制备:某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种,需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐,这就是摇瓶种子摇瓶相当于微缩了的种子罐,其培养基配方和培养条件与种子罐相似摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养 ⑵ 种子罐种子制备:种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备孢子或摇瓶菌丝被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵 螺旋霉素的种子制备需采用种子罐种子植被的方式,并采用二级发酵的方式 接种龄:接种处于对数期的细菌 接种量:接种量定为8% 种子培养要求一定量的种子,在适宜的培养基中,控制一定的培养条件和培养方法,从而保证种子正常生长工业微生物培养法分为静置培养和通气培养。