蛋白质结构与功能.ppt
135页
蛋白质的结构与功能 protein ？？ 含量大含量大 分布广分布广 种类多种类多 功能繁杂功能繁杂 蛋白质的重要性蛋白质的重要性1234 蛋白质的生物活性蛋白质的生物活性催催化化作作用用调调节节作作用用免免疫疫作作用用载载体体作作用用凝凝血血作作用用运运动动作作用用组组织织更更新新修修复复 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成 1 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的理化性质及其分离纯化蛋白质的理化性质及其分离纯化 2 3 4 第一节蛋白质的分子组成 一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成 C、、H、、O、、N （（16%））和 S 主要主要 少量少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘 蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16％％ 样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量 ( g ) ( g )= = 样品含氮量样品含氮量× × 6.251/16%问题问题1 1样品中蛋白质含量的测定？样品中蛋白质含量的测定？ 二、二、 氨基酸（氨基酸（amino acid））氨基酸是蛋白质的基本组成单位氨基酸是蛋白质的基本组成单位自然界自然界300300余种余种人体人体编码编码AAAA：：2020种种结构结构均属均属L-α-L-α-氨基酸氨基酸甘氨酸除外甘氨酸除外 NH2HRCOOHCα氨基酸的一般结构（氨基酸的一般结构（ L-α-氨基酸）氨基酸）中心中心αα碳原子碳原子羧基羧基氨基氨基氢原子氢原子侧链侧链 L-AAL-AA D-AAD-AA 人体蛋白质中为人体蛋白质中为L-L-α- AA- AA 中文名中文名英文名英文名缩写写pKapI三字符三字符一字符一字符pK1（（-COOH））pK2（（-NH3+））pKR（（R基）基）甘氨酸glycine Gly G2.349.605.97丙氨酸alanine Ala A2.349.696.01脯氨酸prolinePro P1.9910.966.48缬氨酸valineVal V2.329.625.97亮氨酸leucineLeu L2.369.605.98异亮氨酸isoleucineIle I2.369.686.02蛋氨酸methionineMet M2.289.215.74苯丙氨酸phenylalaninePhe F1.839.135.48酪氨酸tyrosineTyr Y2.209.1110.075.66色氨酸tryptophanTrp W2.389.395.89丝氨酸serineSer S2.219.155.68苏氨酸threonineThr T2.119.625.87半胱氨酸cysteineCys C1.9610.288.185.07天冬酰胺asparagineAsn N2.028.805.41谷氨酰胺glutamineGln Q2.179.135.65赖氨酸lysineLys K2.188.9510.539.74组氨酸histidineHis H1.829.176.007.59精氨酸arginineArg R2.179.0412.4810.76天冬氨酸aspartic acidAsp D1.889.603.652.77谷氨酸glutamic acidGlu E2.199.674.253.22 （二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类 非极性氨基酸非极性氨基酸 1 2 4 5 不带电荷的极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸 带正电荷的碱性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸 带负电荷的酸性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸 3 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 不不带带电电荷荷的的极极性性氨氨基基酸酸 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 带带正正电电荷荷的的碱碱性性氨氨基基酸酸 酸酸性性氨氨基基酸酸 +胱氨酸胱氨酸-HH半胱氨酸半胱氨酸二二 硫硫 键键 记忆口诀记忆口诀甘、丙、缬、亮、异，三、四碳烃基甘、丙、缬、亮、异，三、四碳烃基丙、丁羟丝、苏，（半）胱、蛋含有硫丙、丁羟丝、苏，（半）胱、蛋含有硫酸有天冬、谷，碱有精、赖、组酸有天冬、谷，碱有精、赖、组苯、酪、色、脯环，中性天、谷胺苯、酪、色、脯环，中性天、谷胺 要点要点编码编码AA 20种种除除G外均为外均为L-型型 P为环状亚为环状亚AA 含羟基含羟基AA：：S、、T、、Y 含硫含硫AA：：C、、M 芳香芳香AA：：F、、Y、、W 支链支链AA：：V、、L、、I 酸性酸性AA：：D、、E 碱性碱性AA：：R、、K、、H （三）氨基酸的理化性质（三）氨基酸的理化性质（（1 1）） 两性解离及等电点两性解离及等电点解离程度取决于所处溶液的酸碱度解离程度取决于所处溶液的酸碱度氨基酸是两性电解质氨基酸是两性电解质1 1、物理性质、物理性质: :白色晶体，熔点较高，溶白色晶体，熔点较高，溶解度大小不一。
解度大小不一2 2、化学性质、化学性质 pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH 氨基酸的种类、数量及比例定义定义主要化学键主要化学键肽键肽键 有些蛋白质有有些蛋白质有二硫键二硫键 牛胰核糖核酸酶的一级结构牛胰核糖核酸酶的一级结构二硫二硫键键 牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 (secondary structure)蛋白质分子中多肽链蛋白质分子中多肽链主链主链骨架骨架原子的局部空原子的局部空间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象定义定义主要化学键主要化学键氢键氢键 β-折叠折叠β-转角转角无规卷曲无规卷曲α-螺旋螺旋蛋白质二级结构蛋白质二级结构的主要形式的主要形式 （一）（一） - -螺旋螺旋 α-α-螺旋螺旋 要点要点1一圈一圈3.6个氨基酸残基，螺距个氨基酸残基，螺距0.54nm 2螺旋稳定靠氢键，与螺旋长轴平行螺旋稳定靠氢键，与螺旋长轴平行呈右手螺旋呈右手螺旋侧链影响螺旋的形成和稳定侧链影响螺旋的形成和稳定34 （二）（二） - -折叠折叠 要点要点1顺向平行和反向平行两种构象顺向平行和反向平行两种构象2呈伸展、锯齿状结构呈伸展、锯齿状结构折叠的稳定靠氢键折叠的稳定靠氢键34侧链影响折叠的形成和稳定侧链影响折叠的形成和稳定 β-β-折叠折叠( (反平行反平行) ) β-β-折叠折叠( (平行平行) ) （三）（三） β-β-转角转角 无规卷曲无规卷曲 没有确定规律性的部分肽没有确定规律性的部分肽链构象。 链构象 超二级结构（模体超二级结构（模体motif））多肽链内顺序上相互邻近的多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体规则的二级结构聚集体 基本形式基本形式1β -折叠组合（折叠组合（ ββ ））2α-螺旋组合（螺旋组合（ αα ））α-螺旋螺旋β -折叠组合（折叠组合（ βαβ ））3 钙结合蛋白钙结合蛋白锌指结构锌指结构 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 (tertiary structure)整条肽链中全部氨基酸残基的相对空整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置即肽链中间位置即肽链中所有原子所有原子在三维空在三维空间的整体排布间的整体排布定义定义 结构域结构域(domain) 蛋白质形成三级结构时，蛋白质形成三级结构时，肽链中某些局部的超二级结构肽链中某些局部的超二级结构汇集在一起，形成的发挥生物汇集在一起，形成的发挥生物学功能的区域；是蛋白质构象学功能的区域；是蛋白质构象中特定的空间区域中特定的空间区域 细胞表面蛋白细胞表面蛋白CD4CD4分子分子4 4个相似结构域个相似结构域 肌红蛋白（肌红蛋白（MbMb）的三级结构）的三级结构血红素血红素铁原子铁原子 稳定三级结构的化学键稳定三级结构的化学键主要化学键是次级键主要化学键是次级键疏水作用、离子键、氢键疏水作用、离子键、氢键和和 Van der Waals力力 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 (quaternary structure)由两条或两条以上具有独立三级结构由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链，通过次级键缔合而成的最的多肽链，通过次级键缔合而成的最高级结构。 高级结构定义定义化学键化学键疏水作用、氢键、离子键、疏水作用、氢键、离子键、范德华力范德华力亚基亚基每条具有独立三级结构的多肽链每条具有独立三级结构的多肽链 血红蛋白血红蛋白（（Hb））的四级结构的四级结构α链链β链链血红素血红素 蛋白质的分类蛋白质的分类根根据据组组成成结合蛋白质结合蛋白质单纯蛋白质单纯蛋白质蛋白质部分蛋白质部分非蛋白质部分非蛋白质部分 根根据据形形状状球状蛋白质球状蛋白质纤维状蛋白质纤维状蛋白质 根根据据功功能能调节蛋白调节蛋白酶蛋白酶蛋白运输蛋白运输蛋白结构蛋白结构蛋白 根根据据分分布布核蛋白质核蛋白质膜蛋白质膜蛋白质 第三节蛋白质结构与功能的关系 蛋白质一级结构蛋白质一级结构与功能的关系与功能的关系一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础一级结构是功能的基础一级结构是功能的基础一级结构改变与分子病一级结构改变与分子病 牛胰核糖核酸酶的一级结构牛胰核糖核酸酶的一级结构一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础二硫二硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 β-β-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、痕量痕量β-β-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 分子伴侣分子伴侣(chaperon)(chaperon) 是一类帮助是一类帮助新生多肽链正确折叠的蛋白质新生多肽链正确折叠的蛋白质 一级结构是功能的基础一级结构是功能的基础结构不同，功能不同结构不同，功能不同血管升压素和催产素血管升压素和催产素结构相似，功能相似结构相似，功能相似胰岛素胰岛素促肾上腺皮质激素和促黑激素促肾上腺皮质激素和促黑激素 一级结构改变与分子病一级结构改变与分子病分子病分子病由于基因突变导致蛋白质一级结构由于基因突变导致蛋白质一级结构与正常有所不同，表现出生理功能与正常有所不同，表现出生理功能的异常，而引起的遗传性疾病。 的异常，而引起的遗传性疾病案案 例例镰刀状红细胞性贫血镰刀状红细胞性贫血 （（a a）正常红细胞）正常红细胞（（ b b）镰型红细胞）镰型红细胞 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) HbS β 肽肽 链链HbA β 肽肽 链链N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · ·C(146) 蛋白质的功能依赖于特定的空间结构蛋白质的功能依赖于特定的空间结构胰岛素原转变成胰岛素胰岛素原转变成胰岛素胰岛素原胰岛素原（一条肽链）（一条肽链）胰岛素胰岛素（两条肽链）（两条肽链）C肽肽二、蛋白质空间结构二、蛋白质空间结构与功能的关系与功能的关系 肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白的空间构象变化与结合氧血红蛋白的空间构象变化与结合氧 O2 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线 协同效应：协同效应：一个亚基与其配体结合后，能影响其一个亚基与其配体结合后，能影响其 中另一个亚基与配体结合能力的现象中另一个亚基与配体结合能力的现象 。 协同效应协同效应( (cooperativity) )正协同效应正协同效应(positive cooperativity) 促进作用促进作用 负协同效应负协同效应(negative cooperativity) 抑制作用抑制作用 某些小分子物质作用于蛋白质的非活某些小分子物质作用于蛋白质的非活性部位后，使其发生构象变化，从而影性部位后，使其发生构象变化，从而影响其功能响其功能变构效应变构效应(allosteric effect) 蛋白质空间结构改变与疾病蛋白质空间结构改变与疾病 蛋白质构象病（蛋白质构象病（protein conformational protein conformational diseasesdiseases））因蛋白质折叠错误或折叠不能导致构象异常因蛋白质折叠错误或折叠不能导致构象异常变化引起的疾病变化引起的疾病 蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理某些蛋白质错误折叠后相互聚集，形成抗蛋白某些蛋白质错误折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病 朊病毒病朊病毒病 朊病毒蛋白构象相关的疾病朊病毒蛋白构象相关的疾病人类朊病毒病人类朊病毒病 库鲁病、脑软化病、新变异型库鲁病、脑软化病、新变异型CJDCJD等等动物的朊病毒病动物的朊病毒病 疯牛病、羊骚痒症等疯牛病、羊骚痒症等 朊病毒：朊病毒：不含有核酸，对各种理化作用有不含有核酸，对各种理化作用有很强的抵抗力很强的抵抗力、、传染性极强的蛋白质颗粒。 传染性极强的蛋白质颗粒PrPcαα- -螺旋螺旋PrPscβ-β-折叠折叠正常正常致病型致病型朊病毒蛋白朊病毒蛋白(prion protein, PrP) 第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化 蛋白质蛋白质的理化性质的理化性质蛋白质蛋白质的等电点的等电点( ( isoelectric point, pI) )当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的性离子，净电荷为零，此时溶液的pHpH称称为为pIpI（一）两性电离及等电点（一）两性电离及等电点 Pr Pr是两性电解质在溶液中的带电状况是两性电解质在溶液中的带电状况主要取决于溶液的主要取决于溶液的pHpH值PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2OH-H+OH-H+pH=pIpH 的丧失 变性变性本质本质破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构一级结构变性因素变性因素物理因素物理因素：高温、紫外线、：高温、紫外线、X X射线、射线、超声波、剧烈振荡等超声波、剧烈振荡等化学因素化学因素：强酸、强碱、重金属离子、尿：强酸、强碱、重金属离子、尿素、乙醇等有机溶剂素、乙醇等有机溶剂 理化性质变化理化性质变化黏度增大黏度增大吸收光谱改变吸收光谱改变溶解度降低溶解度降低易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解 蛋白质变性程度较轻，去除变蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能恢复其原有的构象和功能蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)(renaturation) 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 β-β-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、β-β-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕而聚集，从溶液中析出互缠绕而聚集，从溶液中析出.蛋白质沉淀蛋白质沉淀沉淀本质沉淀本质破坏水化膜破坏水化膜中和电荷中和电荷 中性盐中性盐沉淀方法沉淀方法有机溶剂有机溶剂生物碱试剂生物碱试剂重金属离子重金属离子 应用应用重金属中毒口服牛奶或生鸡蛋重金属中毒口服牛奶或生鸡蛋 蛋白质变性后的絮状物加热可变蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，不易再溶于强成比较坚固的凝块，不易再溶于强酸和强碱中。 酸和强碱中蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein (protein coagulation) coagulation) 变性、沉淀、凝固的关系变性、沉淀、凝固的关系变性变性沉淀沉淀容易容易不一定不一定凝固凝固一定一定一定一定 应用应用消毒消毒鸡蛋要煮熟吃鸡蛋要煮熟吃疫苗保存疫苗保存 （四）蛋白质的光谱吸收与呈色反应（四）蛋白质的光谱吸收与呈色反应 280nm最大吸收峰最大吸收峰OD280 ：： W 、、 Y蛋白质的光谱吸收蛋白质的光谱吸收 双缩脲反应双缩脲反应蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应酚试剂呈色反应酚试剂呈色反应考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 蛋白质蛋白质的分离和纯化的分离和纯化方法方法 盐析盐析 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 （一）改变蛋白质的溶解度 将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀破坏，导致蛋白质沉淀盐析盐析(salt precipitation) 低温低温(0~4 0C)快速快速有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 方法方法 离心离心 透析与超滤透析与超滤 凝胶过滤层析凝胶过滤层析（二）（二）根据蛋白质分子大小不同分离根据蛋白质分子大小不同分离 利用机械的快速旋转所产生利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。 质分离开来的方法离心离心（（centrifugation）） 利用透析袋把大分子蛋白质与利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法小分子化合物分开的方法透析透析( (dialysis) )纯化蛋白质纯化蛋白质浓缩蛋白质浓缩蛋白质作用作用 超滤超滤利用超滤膜在一定压力下利用超滤膜在一定压力下使大分子蛋白质滞留，而使大分子蛋白质滞留，而小分子物质和溶剂滤过小分子物质和溶剂滤过 凝胶过滤凝胶过滤（（gel-filtration chromatography））按照天然蛋白质相对分子质量大按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析筛层析或排阻层析 方法方法 离子交换层析离子交换层析 电泳电泳 （三）（三）根据蛋白质电荷性质分离根据蛋白质电荷性质分离 离子交换层析离子交换层析（（ion exchange chromatography））利用蛋白质两性解离特性和等电点利用蛋白质两性解离特性和等电点作为分离依据作为分离依据 电泳电泳(elctrophoresis(elctrophoresis））带点粒子在电场作用下向所带电荷相带点粒子在电场作用下向所带电荷相反电极移动的现象反电极移动的现象支持物支持物的不同分为薄膜电泳、凝胶电的不同分为薄膜电泳、凝胶电泳泳 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 常用于蛋白质分子量的测定常用于蛋白质分子量的测定等电聚焦电泳等电聚焦电泳 依据蛋白质等电点的差异分离依据蛋白质等电点的差异分离双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE) (2-DE) 蛋白质组学研究的重要技术蛋白质组学研究的重要技术 SDS-PAGE SDS-PAGE 可测定蛋白质分子量 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（（isoelectric focusing isoelectric focusing electrophoresis,IFEelectrophoresis,IFE）在具有在具有pHpH梯度的电场中，蛋白质按其梯度的电场中，蛋白质按其等电点不同予以分离等电点不同予以分离 等电聚焦的原理等电聚焦的原理 双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）利用不同蛋白质所带电荷和质量的差利用不同蛋白质所带电荷和质量的差异，用两种方法、分两步进行的蛋白异，用两种方法、分两步进行的蛋白质电泳质电泳第一步第一步 按不同的按不同的等电点等电点进行分离进行分离 第二步第二步 按不同按不同质量质量再分离再分离 双向电泳的原理双向电泳的原理 。
