MS培养基及配制注意事项.pdf

母液 成分 规定 量 浓缩 倍数 称取量 （mg） 母液 体积 （ml） 配制1 升培 养基 吸取 量定 容 编 号 种 类 1 大 量 元 素 KNO319001019000 1000 100 NH4NO316501016500 MgSO47H2O370103700 KH2PO4170101700 2 CaCl22H2O4401044001000100 3 微 量 元 素 MnSO44H2O22.31002230 1000 10 ZnSO47H2O8.6100860 H3BO36.2100620 KI0.8310083 Na2MoO47H2O0.2510025 CuSO4.5H2O40.0251002.5 CoCL2.6H2O0.0251002.5 4铁 盐 Na2-EDTA37.31003730100010 FeSO4.4H2O27.81002780 5 有 机 甘氨酸2.0100100 500 10 盐酸吡哆醇0.510025 一、MS培养基母液的配制 物盐酸硫铵素0.11005 烟酸0.510025 6 肌酸100100500050010 注意：1大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化 合物称量后，除CaCl22H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯 中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏 水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编 号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl22H2O配制同上置于另 一小口瓶中。

2微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐 （FeSO47H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物 可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小 口瓶中保存，贴上标签 3铁盐配制将FeSO47H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水 中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水 定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签 4有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量 外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保 存，贴上标签 5母液最好在24的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜 过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就 不能再使用 1 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准 要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯） 2 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配 成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸 （NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米 素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热 激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸 需用少量稀氨水溶解 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母 液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（04） 保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为 0.5mg时，则取1ml母液即可 二、培养基配制和灭菌 一养培养基配制程序 (一).母液吸取量的计算 配制培养基的升数 公式1：母液吸取量= 母液体积（CC） 母液浓缩倍数 培养基要求的含量 公式2：母液吸取量= （各种生长调节剂） 母液每CC的含量 （二） 各种母液按顺序编号排列 A. 大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素 ；D.铁盐； E.有机 物； F生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA 用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、 激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后, 加蒸馏水定容至100ml。

(三)配制培养基（1000ml） 1. 琼脂: 称取57g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全 溶解为止. 2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼 脂的300ml蒸馏水中 3. 各种母液的吸取（培养基1L） （1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl22H2O母 液（B）各100ml （2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐 （D）母液各10ml （3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml （4） 移取激素 将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至 80左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.86.0， 过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整 二分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装 到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容 量1/41/3左右）注：培养基勿碰瓶壁 三.包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进 行灭菌 用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、 烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法 具体操作步骤： 1. 高压锅放水至平把架； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅; 3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀. 4. 然后接通电源. 5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要) 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭 菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针 下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟 7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待 高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍 待冷后再把培养基取出 8.经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用 前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25下保存4天，如 果培养基需要贮存较长时间，可在4低温下保存 灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格， 无论哪种型号，操作的步骤都很相近 进水放进培养基盖紧锅盖关上放汽阀检查安全阀接上加热 源待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀 0.11MPa(121)下灭菌2025分钟，保持稳定压力除热源逐渐打 开放气阀锅内空气排除完后开放锅盖稍冷后取出培养基。

四、无菌操作技术 （一）植物材料表面消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物这些污 染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染因此，植物材料必须经严 格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接 种 1.接种步骤： 第一步：清理材料流水冲洗加入吐温（或洗衣粉）清洗 自来水冲洗 第二步：对材料的表面浸润灭菌 ： 70%酒精浸10-30秒无菌水 第三步：灭菌剂处理 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂） 第四步：无菌水进行冲洗 注意事项： .灭菌剂一般要临时配制，现配现用升汞可以短期储存 .对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗-次，升汞一般- 次，每次不少于min .灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底 .灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止 .灭菌液要充分浸没材料 2.无菌操作可按以下步骤进行： （1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外 线灯进行杀菌； （2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯； （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； （4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。

然后搽拭工 作台面； （5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一 遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； （6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽 等； 材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切 割如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段微茎尖要 剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉 污染 （7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连 续接种，每5天要大强度灭菌一次 常用植物激素 类别名称缩写词分子量使用浓度范 围 母液配制说明 生长 素 2，4二氯苯氧 乙酸 2，4D221.00.001 10mg/L 生长素通 常用NaOH 溶液滴至 溶解成溶 液 能溶于乙 醇 IAA易被 植物细胞 所氧化 故培养基 中很少单 独使用 萘乙酸NAA186.20.001 10mg/L 吲哚3乙酸IAA175.20.001 10mg/L 吲哚3丁酸IBA203.20.001 10mg/L 细 胞 分 裂 6苄基氨基嘌呤BA225.2 分裂素通 常能溶于 稀NaOH， 含水乙醇 或稀盐酸 玉米素不 耐热，不 能高压灭 菌。

6糠基氨基嘌呤KT215.2 N异戊烯氨基嘌 呤 （玉米素） ZT219.2 赤 霉 素 赤霉素GA3346.4 能溶于乙 醇 不耐热不 能高压灭 菌在愈伤 组织和悬 浮培养物 的启动和 保持生长 时才需要 有时小植 株再生时 也需要 四、常用药品的配置方法 1.1mol/L HCl的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫 升，假设要配制1000ml 1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为1mol， 所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml 2.1mol/L的NaOH的配制：称40gNaOH，然后融于1000ml的蒸馏水中 （定容到100ml） 3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入 200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精 如果用无水酒精配制75%的酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水 250ml 4.0.1%的升汞配制：先称取1克升汞粉末，然后用蒸馏水溶解最后定容 到1000ml 5. 1mg/ml的2.4-D的配制：称取0.1g2.4-D，用少量1mol/LnaOH或酒精助 溶，然后定容到100ml。

6.1 mg/ml的6-BA的配制：称取0.1g6-BA，用少量1mol/L HCl或 1mol/LNaOH助溶，然后定容到100ml 7.0.5mg/ml的NAA的配制：称取0.05gNAA，用少量95%酒精助溶，然 后定容到100ml 。