实验四PCR基因扩增.ppt

实验四 PCR基因扩增实验目的l通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术实验原理l聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法l在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍PCR技术的原理l1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性l2.退火：是模板与引物的复性引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段l3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 25’5’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’( (d)d)新引物新引物新引物新引物5’5’3’3’靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5’5’3’3’引物引物引物引物1 13’ 3’ 5’5’3’3’5’5’引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5’ ’3 3’ ’3 3’ ’5 5’ ’引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)温度温度温度温度（（（（℃℃℃℃））））时间时间时间时间（（（（minmin））））9494727260609494℃℃℃℃变性变性变性变性（（（（1 1minmin））））60 60 ℃℃℃℃退火退火退火退火（（（（1 1minmin））））72 72 ℃℃℃℃延伸延伸延伸延伸（（（（1.51.5minmin））））循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。

图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94℃94℃94℃94℃变性变性变性变性1 1 1 1minminminmin，，，， 60 ℃ 60 ℃ 60 ℃ 60 ℃退火退火退火退火1 1 1 1minminminmin，，，， 72 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 72 ℃延伸延伸延伸延伸1.51.51.51.5minminminmin如此周而复始，重复进行，直至扩增如此周而复始，重复进行，直至扩增如此周而复始，重复进行，直至扩增如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止产物的数量满足实验需求为止产物的数量满足实验需求为止产物的数量满足实验需求为止一般一般PCR反应条件反应条件实验仪器电泳仪电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽PCR仪仪凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统移液器移液器实验材料l1、DNA模板l2、4种dNTPl3、引物1、引物2l4、Taq酶l5、琼脂糖l6、DNA相对分子质量标准物l7、吸头、50ul PCR管试剂l10×PCR缓冲液(含Mg2＋)l4×dNTP (每种1mmol)lTag酶  1U/ullDNA模板l引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3`l引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` l引物溶液浓度 10pmol/ul实验步骤l1在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系： CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410× PCR Buffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020PCRPCR反应程序反应程序(1) 94℃(1) 94℃(1) 94℃(1) 94℃变性变性变性变性5min5min5min5min，，，，(2) 94℃(2) 94℃(2) 94℃(2) 94℃变性变性变性变性1min1min1min1min，，，， (3) 52 ℃(3) 52 ℃(3) 52 ℃(3) 52 ℃退火退火退火退火1min1min1min1min，，，， (4) 72 ℃(4) 72 ℃(4) 72 ℃(4) 72 ℃延伸延伸延伸延伸1min1min1min1min。

5) (5) (5) (5) 重复重复重复重复(2)-(4)30(2)-(4)30(2)-(4)30(2)-(4)30次次次次（（（（6 6 6 6））））72 ℃72 ℃72 ℃72 ℃延伸延伸延伸延伸1min1min1min1min实验报告l要求：l1、写出本实验目的、原理；l2、实验器材及实验步骤；l3、列出实验结果示意图并分析原因实验结果PCR结果1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）。