【最新word论文】聚乙烯醇纺丝纤维编织在组织工程前交叉韧带支架材料中的应用【临床医学专业论文】.doc

1聚乙烯醇纺丝纤维编织在组织工程前交叉韧带支架材料中的应用作者：戴丽冰，邹海燕，叶春婷，白利明，杨小红，沈雁，陈鸿辉，谭见容【摘要】 探讨聚乙烯醇（PVA）纺丝纤维编织用 I 型胶原胶（COL-I）表面修饰后，构建组织工程前交叉韧带（ACL）支架材料的可行性用 PVA 纺丝编织成条束状支架材料，用 NIH-3T3 细胞株和人前交叉韧带（HACL）细胞分别种植到PVA 和经 COL-I 修饰过的 PVA 纺丝纤维编织（PVA/COL）支架材料上，立体培养通过扫描电子显微镜对比评价材料经 I 型胶原胶表面修饰前后 NIH-3T3 细胞株和HACL 细胞在纺丝编织材料上细胞附增殖情况；在电子拉力机上测试 PVA 纺丝纤维编织支架材料的力学性能结果表明：NIH-3T3 细胞株和 HACL 细胞在 PVA 和PVA/COL 支架材料表面和孔隙内黏附增殖并分泌细胞外基质，在 PVA/COL 支架材料上细胞黏附数量明显增多； COL-I 可促进 NIH-3T3 细胞株分泌细胞外基质，但对 HACL 细胞作用不明显拉力测试该编织材料柔韧性强，最大负荷、极限应力和弹性模量分别为 52.61 N、14.96 Mpa 和 202.08 Mpa。

说明 I 型胶原可促进NIH-3T3 细胞株和 HACL 细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖，可促进 NIH-3T3 细胞株分泌细胞外基质聚乙烯醇纺丝纤维编织材料具有一定的力学性能和细胞相容性，有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料关键词】 聚乙烯醇；纺丝编织；I 型胶原；前交叉韧带；组织工程Abstract：To investigate the application feasibility of PVA scaffold modified by COL-I to construct anterior cruciate ligament tissue engineering.Braide stripe scaffold with PVA spinning collagen waving.NIH-3T3 cell line and human anterior cruciate ligament cells(HACL) were cultured and expanded in vitro and they were seeded into the scaffold which was braided with PVA, and PVA was modified by COL-I(PVA/COL). The growth situation of seeded cells into the scaffold was observed under the scanning electron microscope(SEM)，the mechanical properties of the scaffold was tested with the electronic tensioner.Results showed that the porous structure of the scaffold facilitated the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line an HACL cells, and extracellular matrix was secreted. Cells adhered and spreaded better on the PVA/COL scaffold than on the PVA materials. COL-I could promote NIH-3T3 cell line to secrete extracellular matrix ,but no obvious effect on HACL was found. Pull tests showed that the flexibility of the material was strong，the peak load was 52.61N，the ultimate stress and elastic modulus was 14.96 Mpa and 202.08 Mpa respectively.COL-I could promote the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line and HACL cells,it also can promote NIH-3T3 cell line 2to secrete extracellular matrix, the scaffold braided with PVA/COL provide with good mechanical properties and biocompatibility,it is hopeful to become a useful scaffold in anterior cruciate ligament tissue engineering.Key words：Polyvinyl alcohol; Spinning braiding; Type I collagen; Anterior cruciate ligament; Tissue engineering1 引 言前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）的断裂一般难以自愈，目前主要的治疗方法是自体或异体移植物和人工合成材料进行 ACL 重建。

自身供体存在来源有限、供区并发症等问题异体移植存在免疫排斥和疾病传播的风险且也受存在来源限制无活性的各种人工合成替代材料重建 ACL 远期疗效还存在争议，限制了其临床应用组织工程技术的发展和应用为 ACL 重建提供了新的思路和途径I 型胶原蛋白是一种具备生物活性的大分子物质，是细胞外间质的主要成分它与细胞的增生、分化以及眼球的润滑、折光率等有着密切的关系，对伤口愈合、血液凝固起着重要的作用胶原分子结构的不对称性和大量亲水基团的存在，使之具有高度的黏附性和亲水性在细胞迁移时能起支持和润滑作用，还可诱导产生趋化因子如血小板生长因子和纤连蛋白等，从而对细胞的生长有趋化作用［1］ 此外，胶原蛋白体内应用不仅具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性，还具有药物缓释的功能因此，胶原蛋白作为一种安全的医用生物材料已广泛用于科研和临床，美国食品药物管理局（FDA）已批准其作为人工皮肤的材料［2-3］ 本实验拟用聚乙烯醇（polyviny alcohol，PVA）纺丝纤维编织构建韧带支架材料，并用 I 型胶原胶进行表面修饰，观察胶原胶是否能促进 NIH-3T3 细胞株、人 ACL 细胞(Human ACL,HACL 细胞）在编织材料上黏附增殖，并对其力学性能进行测试。

2 材料和方法2.1 材料I 型胶原蛋白胶为广州市创伤外科研究所研制的胶原胶制剂 （取大鼠尾筋腱用酸溶解法提取 I 型胶原［4］ ，胶原提取液透析纯化为胶原胶，经双缩脲试验、凯氏定氮试验、氨基酸成分分析、SDS-PAGE 电泳、羟脯氨酸含量、紫外光谱最大吸收峰 max≌226 nm、奥氏黏度计比黏度试验 η=50±10、pH=5.5±0.1、蛋白浓度（3±0.2）g/L,证明确属 I 型胶原蛋白胶原蛋白的商业性提取方法已获得美国专利登记 NO.2979438.1961） 2.2 主要试剂和仪器3高糖 DMEM 培养基（Dulbecco′s modified Eagles medium）Gibco（USA） ；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；25 cm2 细胞培养瓶(Corning，USA)；6 孔细胞培养板(Corning，USA)；NIH-3T3 细胞株，PVA 纺丝纤维(上海东华大学材料科学与工程学院)；0.2-200 μL 微量加样器(Nipar，Japan)；光学显微镜（ECLIPSE E400，Nikon Japan） ；倒置显微镜（IMP-2 OLMPUS，Japan） ；自动平衡离心机（LDZ4-0.8，北京离心机厂)；高速冷冻离心机(SORVALL RC 5C，USA） ；CO2 培养箱(SHELLAB2323，USA)；超净工作台(苏州苏净集团安泰公司)；电子拉力测试机(Hounsfield H25KSS ，UK） ；扫描电子显微镜(PHILIPS ESEM-30)；60Co 放射源(广州辐照技术研究中心)。

2.3 实验方法2.3.1 支架材料的制作和分组 用 PVA 纺丝经过手工编织形成有孔、无色透明、质地较柔软、具有一定韧性和弹性的条束状支架材料修剪成 21 mm×2.4 mm×1.4 mm 大小的韧带支架材料若干条分别经 0.1 mol/L 稀盐酸(HCL)—蒸馏水—0.1 mol/L 氢氧化钠(NaoH)—蒸馏水超声洗涤，以彻底清除在纺丝和编织过程中黏附在纤维表面和孔隙内的杂质和污物60Co（7kGy）辐照消毒灭菌后分 2组：PVA 组和 PVA/COL 组PVA 组材料种植细胞前用 DMEM 培养基充分浸泡PVA/COL 组材料种植细胞前用 DMEM 培养基浸泡，再用 I 型胶原蛋白胶行表面修饰2.3.2 支架材料的表面修饰 用（3.0±0.2）g/L 鼠尾 I 型胶原蛋白胶（COL-I）浸泡—干燥—再浸泡行表面修饰为了使编织材料内部也能均匀地包被胶原蛋白，采用低温负压抽真空，将编织材料内部的气体排干净浸泡完成后在超净工作台上自然干燥，种植细胞前用 DMEM 培养基浸泡2.3.3 材料的细胞相容性检测 用 NIH-3T3 细胞株体外培养、扩增后，以1×108 L-1 的细胞悬液种植于 PVA 组和 PVA/COL 组支架材料上。

37 ℃、体积分数 0.05 的 CO2 培养箱内孵育 4～6 h，待细胞贴附于支架材料后，加入含体积分数 0.1 的胎牛血清的 DMEM 继续立体培养隔天换培养液 1 次，3 d 和 7 d 收集细胞－支架材料复合物取前交叉韧带断裂重建手术患者的 ACL 组织，经患者或家属知情同意按照组织块和胶原酶消化培养法在体外分离培养并扩增 HACL 细胞［5］ 取 3～5代 HACL 细胞悬液，以 1×108 L-1 的浓度种植于 PVA 组和 PVA/COL 组支架材料上，2 h 后复种 1 次，37 ℃、5% CO2 培养箱内孵育 4～6 h，待细胞贴附于支架材料后，加入含体积分数 0.1 的胎牛血清的 DMEM 继续培养，隔天换培养液 1 次，3 d 和 7 d 收集细胞－支架材料复合物细胞－支架材料复合物经 2.5 %戊二醛固定、常规脱水、CO2 临界点干燥、喷金、扫描电子显微镜（500～2000 倍）对比观察纺丝纤维编织支架材料经 I 型胶原胶表面修饰前后 NIH-3T3 细胞株和 HACL 细胞在纺丝编织材料上细胞的粘附增殖情况42.3.4 材料的力学性能检测 取 6 条编织好的支架材料充份浸泡湿润后，在电子拉力机上以速度 100 mm/min、初始长度为 1 cm 进行负荷—拉伸测试，记录最大负荷、极限应力、最大应变及线性刚度力学指标，应用 SPSS11.5 软件包进行分析。

3 结果3.1 NIH-3T3 细胞株和 HACL 细胞在支架材料上的生长及细胞外基质的分泌情况 电镜扫描可见支架材料表面光滑，孔径大小不一，相互惯通，纤维纵横交错，呈三维连通的编织网状结构；NIH-3T3 细胞株和 HACL 细胞在 PVA 和 PVA/COL 支架材料表面和孔隙内黏附增殖并能分泌细胞外基质，NIH-3T3 细胞株比 HACL 细胞生长旺盛3.1.1 NIH-3T3 细胞株在支架材料生长情况 NIH-3T3 细胞株在 PVA 和PVA/COL 。