基因工程的载体.ppt

第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体前言前言 载体通论载体通论第一节第一节 质粒载体质粒载体第二节第二节 λ噬菌体载体噬菌体载体第三节第三节 单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！前言 载体通论一、基本概念一、基本概念 利用重组利用重组DNA技术分离目的基因，称之为技术分离目的基因，称之为基因克隆基因克隆(gene (gene cloning)cloning)克隆克隆(clone)(clone)：：作物动词时是指从单一祖先产生同一的作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成分子、细胞或个体所组成的特殊群体的特殊群体基因文库基因文库(gene library)(gene library)：由大量的含有基因组：由大量的含有基因组DNA的不同的不同DNA片段的克隆所构成的群体。

片段的克隆所构成的群体载体载体(vector)(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子二、分类二、分类 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 人工染色体人工染色体按载体功能分按载体功能分按载体性质分按载体性质分表达体系表达体系载体体宿主宿主原核生物表达体原核生物表达体系系质粒、噬菌体粒、噬菌体细菌菌酵母表达体系酵母表达体系大大肠杆菌杆菌-酵母菌穿梭酵母菌穿梭质粒粒酵母酵母转基因植物体系基因植物体系大大肠杆菌杆菌-农杆菌穿梭杆菌穿梭载体体（（Ti质粒）、病毒等粒）、病毒等植株植株哺乳哺乳细胞表达体胞表达体系系大大肠杆菌杆菌-农杆菌穿梭杆菌穿梭载体体（病毒）、脂（病毒）、脂质体等体等培养培养动物物细胞胞基因直接基因直接导入入DNA本身（基因本身（基因枪微粒微粒轰击法等）法等）生殖生殖细胞、体胞、体细胞、个体胞、个体三、基因工程载体必须具备的条件：三、基因工程载体必须具备的条件： ※※（（1）有复制起点）有复制起点 ※※（（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※※（（3）具备合适的筛选标记）具备合适的筛选标记 ※※（（4）具备合适的拷贝数目）具备合适的拷贝数目 （（5））分子量要相对较小分子量要相对较小 （（6））在细胞内稳定性要高在细胞内稳定性要高 （（7））易分离纯化易分离纯化※※表示载体必须具备的条件表示载体必须具备的条件第一节第一节 质粒载体一、质粒一、质粒(plasmid)的基本特性的基本特性 Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

质粒质粒是细菌染色体外能是细菌染色体外能自主复制自主复制的环形双链的环形双链DNADNA分子质粒分子质粒DNADNA多呈超螺旋的多呈超螺旋的共价闭合环状共价闭合环状DNA (covalently closed DNA (covalently closed circular, cccDNA)circular, cccDNA)，大小为，大小为1-200kb1-200kb，可以持续稳定地处于，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制随染色体复制而复制编码编码抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的质粒叫的质粒叫R R质粒质粒质粒DNADNA在添加真核复制在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的制的穿梭质粒穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛并在真核细胞中表达，因此应用广泛1 1、质粒的复制、质粒的复制：由复制子：由复制子(ori(ori，复制起始区及与此相关的顺，复制起始区及与此相关的顺式作用元件式作用元件) )决定。

质粒复制的机理请见教材质粒复制的机理请见教材2 2、质粒的拷贝数、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为把质粒分为严紧型复制质粒严紧型复制质粒（拷贝数少，为（拷贝数少，为1-51-5个）与个）与松弛松弛型复制质粒型复制质粒（拷贝数多，可达（拷贝数多，可达10-20010-200个拷贝）作为载体的个拷贝）作为载体的质粒一般应该是松弛型的拷贝数是由复制起始点的类型决质粒一般应该是松弛型的拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如定的，如pMB1pMB1或或ColE1ColE1 pUCpUC系列载体中的突变型系列载体中的突变型pMB1pMB1复制子可达复制子可达500-700500-700个拷贝3、质粒的不亲和性、质粒的不亲和性(inpatibility)：两种亲缘关系密切的不同质：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象涉粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象涉及细胞分裂过程中的竞争性选择及细胞分裂过程中的竞争性选择不相容群不相容群4、质粒的转移性：、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。

的作用而转移到新的宿主细胞中三亲杂交三亲杂交法法质粒载体应具备的条件：质粒载体应具备的条件：1 1 有特定的复制起始子有特定的复制起始子2 2 有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有 1 1个；个；3 3 有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；4 4 有一定容量；有一定容量；5 5 有相当的拷贝数，有相当的拷贝数， 即每个宿主菌可能容纳的最多数即每个宿主菌可能容纳的最多数二、标记基因二、标记基因1、选择标记基因：用于鉴别目的、选择标记基因：用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来载体的宿主挑选出来Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解（氨苄青霉素抗性基因）：水解ββ- -内酰胺环内酰胺环Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。

supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性tRNA，可翻译，可翻译UAG为酪氨酸赭石突变（为酪氨酸赭石突变（UAA），乳白突变（），乳白突变（UGA）正向选择标记：蔗糖致死基因正向选择标记：蔗糖致死基因sacB2、筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来α-互补互补 (α plementation)：人工突变使大肠杆菌的：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因基因(lacZ)缺失缺失N-端的第端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的基因的N-端端140个氨基酸和编码区段个氨基酸和编码区段(lacZ’)，二者单独，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的能互补，形成具有完全活性的LacZ酶多克隆位点多克隆位点(multiple cloning site)：载体上的一段人工设计和人：载体上的一段人工设计和人工合成的工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。

酶的切点，以方便载体与外源片段的重组插入失活插入失活(insretional inactivation)：当一段足够长的外源：当一段足够长的外源DNA片片段插入到一个功能基因的编码区后，导致段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活蓝白斑筛选蓝白斑筛选(white-blue screening)：空载体转化子经：空载体转化子经IPTG诱导表诱导表达后，由于达后，由于α-互补而形成的功能性的互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化蛋白，能够转化无色底物无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色色(蓝斑蓝斑)；重组载体的转化子中，由于；重组载体的转化子中，由于lacZ’基因的插入失活基因的插入失活而不能形成而不能形成α-互补，在互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑不条件下菌落或噬菌斑不显蓝色显蓝色(白斑白斑) ；通过菌落或噬菌斑的蓝；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的选鉴定出重组子与非重组子的目的。

三、质粒载体的种类三、质粒载体的种类质粒的发展阶段质粒的发展阶段 第第一一阶段（阶段（19771977年前）年前）：天然质粒和重组质粒：天然质粒和重组质粒的利用，如的利用，如pSC101pSC101、、ColE1ColE1、、pCRpCR、、pBR313pBR313和和pBR322pBR322 第第二二阶段阶段：：增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），（降低载体长度），建立建立多克隆位点区多克隆位点区和和新的遗传标记基因新的遗传标记基因如pUCpUC系系 列载体 第第三三阶段阶段：完善载体功能以：完善载体功能以满足基因工程满足基因工程克隆克隆中的不同要求，如中的不同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3、、T7T7、、SP6SP6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体启动子载体，表达型载体及各种探针型载体1 1、克隆载体、克隆载体1 1））pBR322pBR322 pBR322pBR322为为4.36kb4.36kb的环状双链的环状双链DNADNA，其碱基序列已经全部，其碱基序列已经全部清楚。

是最早应用于基因工程的载体之一是最早应用于基因工程的载体之一 把把pBR322pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表表达组件达组件，就可以构建成工作所需的新载体就可以构建成工作所需的新载体 许多实用的质粒载体都是在许多实用的质粒载体都是在pBR322pBR322的基础上改建而成的基础上改建而成可见其原型质粒在使用上有优点可见其原型质粒在使用上有优点 有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单单一切口的位点也多达数十个一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件能切开并插入目的基因的优越条件 有两个抗药性基因（有两个抗药性基因（AmpAmpr r和和TetTetr r））. . 此外，此外，pBR322 DNApBR322 DNA被限制性内切酶消化后产生的片段大被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。

分子质量标准普通型载体pBR322的结构图插插入入失失活活法法以以pBR322pBR322为基础的重组子筛选方法为基础的重组子筛选方法2 2））pUC18/pUC19pUC18/pUC19质粒系列质粒系列 pUC质粒系列是在质粒系列是在pBR322基础上改建成基础上改建成的 它含有它含有pBR322的大部分，包括完整的的大部分，包括完整的Ampr基因和复制起始点去除了基因和复制起始点去除了pBR322的的 tetr区段区段，换用了，换用了M13噬菌体噬菌体的的476bp片段，片段，含含LacZ基因基因及其及其启动子的操纵基因、启动子的操纵基因、M13的的多聚接头多聚接头polylinker pUC18与与pUC19只是多克隆位点的排列只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致方向相反，其余一致 476bp片段含有E. coli的LacZ基 因的 5’序列，表达半乳糖苷酶的α片段 LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O LacZ之内是M13的克隆位点三个显著特点：三个显著特点： （（1 1））分子量更小分子量更小，仅为，仅为2.7 kB2.7 kB，容纳外源，容纳外源DNADNA量增量增大；大；具有更高的拷贝数具有更高的拷贝数（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）个拷贝）。

（（2 2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因LacZ LacZ αα，可利用，可利用αα- -互补原理互补原理进行进行蓝白斑筛选蓝白斑筛选 （（3 3））多克隆位点区（多克隆位点区（multiple cloning site, multiple cloning site, MCSMCS））由人工合成的多个单一酶切位点构成由人工合成的多个单一酶切位点构成 其其MCSMCS区与区与M13mpM13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上上克隆的目的基因直接转移到克隆的目的基因直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行DNADNA测测序序和和体外突变体外突变等研究 3 3））pUC118/pUC119pUC118/pUC119质粒系列质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始和终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，也称为噬菌粒4 4））pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z/4Z质粒系列质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，在多克隆位点两端添加了噬菌体的转录启动子，可用于体外转录和翻译。

5 5））多功能质粒载体多功能质粒载体典型的为pBluescript Ⅱ KS(±)、pBluescript Ⅱ SK (±)，具有多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子、单链噬体的复制与包装信号等K = KpnⅠ，，S = SacⅠ¡2、表达载体、表达载体¡一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等信号肽、诱导表达元件等¡如如Novagen的的pET系列、系列、Qiagen的的pQE系列¡以后有详讲解以后有详讲解第二节第二节 λλ噬菌体载体噬菌体载体一、一、λλ噬菌体的分子生物学噬菌体的分子生物学λλ噬菌体的组成结构和用途噬菌体的组成结构和用途 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的““寄生寄生虫虫””它本身是一种核蛋白，核心是它本身是一种核蛋白，核心是一段一段DNADNA，，结构上有一结构上有一个个蛋白质外壳和尾巴，蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNADNA注注入细菌内。

入细菌内λλ噬菌体为线性噬菌体为线性双链双链DNADNA的细菌病毒的细菌病毒，具有互补的，具有互补的12bp12bp粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状全长粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状全长48531bp48531bp，含，含5050多个基因多个基因λλ噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区：结构区结构区：：A A～～J 19J 19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区组组区区att(attachment)att(attachment)、、int(intagrate)int(intagrate)及及xis(excission)xis(excission)调控区调控区启动子、终止子和启动子、终止子和N N、、CICI基因裂解区：裂解区：Q-RQ-R¡λ噬菌体可以噬菌体可以容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因例如用置换法可去掉长例如用置换法可去掉长达达20kb的的λDNA，换入相应长度的目的基因换入相应长度的目的基因¡ 基因文库构建常使用基因文库构建常使用λ载体¡ 不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用λ组件进行构建组件进行构建。

二、二、λ载体的选择标记载体的选择标记¡1、基因组大小：原基因组的、基因组大小：原基因组的75-105%大小时可以包装，否大小时可以包装，否则不能包装则不能包装¡2、、LacZ基因：象质粒一样进行蓝白斑筛选基因：象质粒一样进行蓝白斑筛选¡3、、cⅠⅠ基因失活：该基因表达时促进进入溶原状态，该基因基因失活：该基因表达时促进进入溶原状态，该基因失活后促进进入裂解状态失活后促进进入裂解状态三、代表性的三、代表性的λλ载体载体1 1、插入型、插入型λλ载体：如载体：如λgt10λgt10、、λgt11λgt11、、Λgem-2/4Λgem-2/4、、λZAPⅡλZAPⅡ、、λExCellλExCell等，一般采用单一切点将等，一般采用单一切点将λλ切开，插入外源切开，插入外源DNADNA，，容量只有容量只有0-11kb0-11kb，主要用于，主要用于cDNAcDNA文库构建、表达融合蛋白、文库构建、表达融合蛋白、合成探针等合成探针等2 2、置换型、置换型λλ载体：载体：λλ的中间裂解生长的非必须区段可以用外的中间裂解生长的非必须区段可以用外源源DNADNA替代，形成填充区段，因此允许的外源替代，形成填充区段，因此允许的外源DNADNA可达到可达到9-9-23kb23kb，代表性载体有，代表性载体有EMBL3/4EMBL3/4、、λ2001λ2001、、λDASHλDASH、、λFIXλFIX、、λGEM-11λGEM-11等，主要用于构建基因组等，主要用于构建基因组DNADNA文库。

文库四、四、λλ载体的克隆原理和步骤载体的克隆原理和步骤1 1、通过裂解过程增殖、通过裂解过程增殖λλ载体2 2、载体与外源、载体与外源DNADNA的酶切载体一般要纯化左路、右臂，并进的酶切载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理行去磷酸化处理3 3、外源、外源DNADNA与载体的连接，形成的是多联体与载体的连接，形成的是多联体4 4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对对DNADNA大小有选择性大小有选择性5 5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过λλ的复制、包装和的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个裂解过程，重组载体得到扩增，一个λλ的感染和扩增会导致的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/ /噬噬菌斑菌斑(plaque)(plaque)6 6、筛选每个噬菌斑代表了一个重组、筛选每个噬菌斑代表了一个重组λλ，所有噬菌斑的集合就，所有噬菌斑的集合就为一个文库为一个文库pfu: plaque forming unitpfu: plaque forming unit，噬菌斑形成单位，指每微克包装，噬菌斑形成单位，指每微克包装λDNAλDNA感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求100100万以上。

万以上第三节第三节 单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体载体一、一、M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，，6407bp，其中，其中90%的的DNA都编码蛋白质，有都编码蛋白质，有10个个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位 M13噬菌体产生单双链噬菌体产生单双链DNA的机制¡1、以、以(+)链链DNA为摸板，合成互补为摸板，合成互补(－－)链，该双链称复制型链，该双链称复制型DNA（（RFDNA）¡2、、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，达每个细胞约在宿主细胞内能快速增殖，达每个细胞约200个个拷贝¡3、单链特异的、单链特异的DNA结合蛋白结合在结合蛋白结合在(+)链上，从而阻断了其链上，从而阻断了其互补链，即互补链，即(－－)链的合成，这样，细胞就会不断的合成链的合成，这样，细胞就会不断的合成(+)链链DNA ++- -+- -+- -+- -+- -+- -单链结合蛋白单链结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200拷贝拷贝+++++以以- -链链DNA为模为模板合成板合成+链链DNA¡4、游离出来的、游离出来的(+)链链DNA先与基因先与基因V的编码产物形成特异的的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的的蛋白质从蛋白质从(+) DNA链上脱落下来，余下的链上脱落下来，余下的M13 (+)链链DNA则则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

包装成病毒颗粒的二和三：略二和三：略四、丝状噬菌体载体的用途和问题四、丝状噬菌体载体的用途和问题用途：制备单链用途：制备单链DNA，用作探针、测序等用作探针、测序等问题：外源问题：外源DNA的部分缺失、外源的部分缺失、外源DNA的单方向插入等的单方向插入等五、噬菌粒五、噬菌粒¡噬菌粒实际上是带有噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒噬菌粒实际上是带有噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区¡可以象质粒一样增殖，而细菌被可以象质粒一样增殖，而细菌被M13（（f1）感染后质粒启动）感染后质粒启动滚环复制，产生质粒滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中菌体颗粒中¡pUC118和和pUC119，，pBluescript SK(±)和和pBluescript KS (±)等¡特征：双链特征：双链DNA稳定、高产，有常规质粒特征；克隆操作简稳定、高产，有常规质粒特征；克隆操作简单；可插入的外源单；可插入的外源DNA可长达可长达10kb。

¡随着随着PCRPCR技术的广泛应用，许多由丝状噬菌体载体完技术的广泛应用，许多由丝状噬菌体载体完成的工作现在已由成的工作现在已由PCRPCR可以取代可以取代。