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复旦大学 博士学位论文 DNA双链断裂NHEJ修复通路基因与人脑胶质瘤相关性的研究 姓名：张海石 申请学位级别：博士 专业：神经外科 指导教师：黄峰平 20070430 复旦大学博士学位论文D N A 双链断裂N H E J 修复通路基因与人脑胶质癌相关性的研究 9 5 ％C I A D A S - P C R B 既 C V C D N AP K D S B R D S B s G S T H R I R L I G 4 蛳) R 埘R N E R N H E J 0 R P E R e a l t i m eP c R S N P T D r r 1 1 n t S N P X R C C 4 X R C C 5 x R C C 6 X R C C 7 ( P R l 【I ) c ) 9 5 ％C o n f i d e n c ei n t e r v a l 9 5 ％可信区间 A l l e l eD i s c r i m i n a t i o n 等位基因分型 A l l e l e - s p e c i f i cP 僳等位基因特异P C R b a s ee x c i s i o nr e p a i r 碱基剪切修复 c r o s s —v a l i d a t i o nc o n s i s t e n c y 交叉验证一致性 D N Ad e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e D N A 依赖蛋白激酶 D N Ad o u b l es t r a n d sb r e a kr e p a i r D N A 双链断裂修复 D N Ad o u b l e s t r a n db r e a k s D N A 双链断裂 g l o b a ls c o r et e s t 总体计分检验 h o m o l o g yr e c o m b i n a t i o n同源重组 I o n i z a t i o nR a d i a t i o n 电离辐射 D N Al i g a s eI V D N A 连接酶4 m u l t i f a c t o rd i m e n s i o n a l i t yr e d u c t i o n 多因素降维法 m i s m a t c hr e p a i r 错配修复 n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r 核苷酸切除修复 N o n —h o m o l o g o u se n dj o i n i n g非同源末端连接 O d d sr a t i o 风险率，几率比 p r e d i c t i o ne r r o r预测误差 R e a lt i m ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 实时定量反转录多聚酶链反应 S i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h y s i m单核苷酸多态性 T r a n s m i s s i o nD i s q u i l i b r i u mT e s t 传递不平衡分析检验 T i s s u eM i c r o —a r r a y s 组织微阵列芯片 T a g g i n gS N P 标签单核苷酸多态性( 位点) X - r a yr e p a i rc r o s sc o m p l o m e n t i n gg e n e4X 射线修复交叉互补基因4 X —r a yr e p a i rc r o s sc o m p l e m e n t i n gg e n e5 X 射线修复交叉互补基因5 ( d o u b l e s t r a n db r e a k r e j o i n i n g ； K u a u t o a n t i g e n ，8 0 k D a ) x - r 8 yr e p a i rc r o s sc o m p l e m e n t i n gg e n e6 ( K u X 射线修复交叉互补基因6 a u t o a n t i g e n ，7 0 k D a ) x —r a yr e p a i rC R O S Sc o m p l e m e n t i n gg e n e7 ：X 射线修复交叉互补基因7 ， p r o t e i nk i n a s e ，D N A - a c t i v a t e d ，c a t a l y t i c D N A 依赖的蛋白激酶催化亚基 p o l y p e p t i d e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

．论文中瞟 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容．可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在解密后遵守此 规定 作者签名导师签名 日期： 复旦大学博士学位论文 卧双链断裂N H E J 修复通路基因与人脑胶质癌相关性的研究 D N A 双链断裂N H E J 修复通路基因与人脑胶质瘤相关性的研究 中文摘要 第一部分：T a q M ∞荧光定量P C R 方法研究删E J 修复基因在人脑胶质瘤中的m R N A 表达 目的采用T a q M a n 荧光定量P C R 技术，研究D N A 双链断裂非同源末端连接 ( N o n —h o m o l o g o u se n dj o i n i n g ，N H E J ) 修复通路5 条基因L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、 X R C C 6 及X R C C 7 在人脑胶质瘤组织标本中的m R N A 表达情况，为揭示D N A 双链断裂 N H E J 修复基因在胶质瘤发生发展中的作用提供依据。

方法术中收集5 0 例胶质瘤组织标本( 星形细胞肿瘤3 0 例，少枝胶质细胞瘤1 0 例，室管貘瘤l O 例) 和l O 例脑外伤正常脑组织标本提取组织标本总f ：N A ，并反 转录为c D N A 所有基因的m R N A 引物参照G e n eB a n k 数据库设计，T a q M a n 探针由 A B I 公司的P r i m e rE x p r e s sv 2 ．0 软件包设计并合成A B l 7 9 0 0 全自动荧光定量P C R 仪实时定量检测候选基因m R N A 表达水平S P S S l 3 ．0 统计分析处理数据 结果与正常脑组织比较，N H E J 修复基因L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R c C 6 及X R C C 7 在脑胶质瘤组织标本中的m R N A 表达均明显降低，具有统计学意义( p < O ．0 5 ) 其 中L I G 4 、X R c C 4 、X R C C 5 的m R N A 表达与胶质瘤的恶性程度呈负相关，提示与胶质 瘤的易感性相关；而X R C C 6 、X R C C 7 的m R N A 表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关， 提示与胶质瘤的预后有密切关系。

结论D N A 双链断裂N H E J 修复通路基因L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 及X R C C 7 在胶 质瘸中的m R N A 表达明显下调，并且在胶质瘤发生发展的不同阶段具有不同的作用， 表明D N A 双链断裂N H E J 修复通路的修复功能障碍与胶质瘤的发生发展密切相关 2 复旦大学博士学位论文D №双链断裂N H E J 修复通路基因与人脑胶质瘤相关性的研究 第二部分：组织芯片( T i s s u e ^ r r a y ) 及W e s t e r nb l o t 方法研究N I I E J 修复基因在 人脑胶质瘤中的蛋白表达 目的应用高通量组织微阵列／组织芯片( h i g h —t h r o u g h p u tt i s s u em i c r o a r r a y ／ t i s s u ec h i p ) 及W e s t e r nb l o t 方法，分析D N A 双链断裂非同源末端连接( N H E J ) 修复基因L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 、X R C C 7 相应编码的蛋白在人脑胶质瘤中的 表达情况。

方法收集2 0 0 4 年1 月～2 0 0 5 年1 2 月手术切除的胶质瘤病理石蜡块标本3 0 0 例， 其中星形细胞肿瘤2 1 4 例( W H OI3 9 例，W H OI I5 8 例，W H OI l l5 7 例，W H OI V 6 0 例) ，少突胶质细胞瘤4 9 例，室管膜瘤3 7 例H E 染色片进行肿瘤定位，每一 张标本的H E 片定两个点，符合肿瘤和瘤旁的有1 6 8 例，符合肿瘤和肿瘤副点的有 1 3 2 例制成组织芯片，应用高通量免疫组化方法根据相应蛋白的表达阳性率和表 达阳性程度，半定量分析N H E J 修复蛋白L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 、X R C C 7 在 胶质瘤中的表达情况同时，选取1 6 例胶质瘤组织标本和8 例脑外伤正常脑组织 标本，应用W e s t e r nb l o t 方法进行相关蛋白的定量检测，验证N t t E J 修复蛋白在 胶质瘤中的表达情况 结果D N A 双链断裂N H E J 修复蛋白L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 、X R C C 7 在胶质瘤 标本肿瘤及瘤旁组织中的阳性表达率均有显著差异，在肿瘤中的阳性表达率明显 低于瘤旁正常组织( P < 0 ．0 5 ) ；并且阳性表达强度也有显著差异，在肿瘤中的阳性 表达强度明显低于瘤旁组织( P < O ．0 5 ) 。

其中L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 6 、X R C C 7 蛋白与 星形细胞肿瘤有关，在星形细胞瘤的肿瘤与瘤旁组织中的阳性表达率也具有显著 差异( P < 0 ．0 5 ) 在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤三种病理类型的比较 中，只有X R C C 7 的阳性表达率和阳性表达强度有显著差异( P < 0 ．0 5 ) W e s t e r nb l o t 定量分析结果表明D N A 双链断裂N H E J 修复蛋白L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 、X R C C 7 在胶质瘤标本中的表达明显低于正常对照组，证实了组织芯片的免疫组化结果 结论高通量组织芯片及W e s t e r nb l o t 结果在蛋白水平证实D N A 双链断裂N H E J 修复基因L I G 4 、X R C C 4 、X R C C 5 、X R C C 6 、X R C C 7 编码蛋白在胶质瘤中的表达明显下 调，与第一部分N H E J 修复基因的m R N A 表达结果相一致，证实D N A 双链断裂N H E J 修复基因及其相应编码蛋白的表达下调在胶质瘤的发病机制中具有重要作用。

3 复旦大学博士学位论文嗍^ 双链断裂H 帷J 修复通路基因与人脑胶质镥相关性的研究 第三部分：D N A 双链断裂N H E J 修复基因单核苷酸多态性与人脑胶质瘤遗。