人脂肪组织基质血管组分分离培养.doc

人脂肪组织基质血管组分分离培养III作者：庄伟，谢良地，黄杰，许昌声【关键词】脂肪组织；细胞外基质；细胞,培养的ABSTRACT: Objective To establish a method for the isolation and culture of stromal vascular fraction(SVF) of human adipose tissue in vitro, which has the characteristics of stem cells. Methods Normal human abdominal subcutaneous adipose tissue was digested with collagenase I and precipitated by centrifuge. The lowest layer cells were suspended and cultured with DMEM F12. Immunofluorescence assay was used to determine the presence of the surface molecule marker CD31 and CD34. Results Immunofluorescence assay showed that about 70% of the 2nd generation of cultured SVF cells were CD34 positive, but CD31 negative. Conclusion A rapid reproducible method was set up for the isolation and culture of SVF with the characteristics of stem cells from human adipose tissue, which possess clinical and research implication of stem cells.KEY WORDS: adipose tissue； extracellular matrix； cells, cultured传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血，在伦理和 供体来源方面受到一定限制。

脂肪组织中基质细胞有多向分 化潜能，可以作为干细胞的来源［1］脂肪基质血管组分 （stromal vascular fraction,SVF）即脂肪组织去除成熟脂 肪细胞后，所获得的具有干细胞特性的基质细胞，相对而言 有更大的优势笔者探索更实用便捷、能够大量反复取样的 SVF分离培养的方法，为人干细胞的研究寻求更便捷的来源, 以期实现临床应用1材料与方法1. 1试剂DMEM F12培养基（含HEPES,美国Gibico 公司），胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS,杭州四季青生物技术 有限公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA,美国 Amresco公司），CD31、CD34山羊源性单克隆抗体、猴抗山羊 FITC二抗（美国Santa Cruz公司），L多聚赖氨酸、I型胶 原酶、胰蛋白酶（美国Sigma公司），25 cm培养瓶（美国 Constar 公司）1. 2方法1.2.1脂肪组织取材 在手术室无菌条件下，取正常 体质量的腹部手术患者的腹部皮下脂肪，置于PBS缓冲液中1.2.2脂肪组织消化 剪取脂肪组织约500 mg,剔除肉 眼可见的血管及纤维部分,PBS冲洗3次，剪切成约1 minXI mmXl mm的组织块,移入酶消化液4 mL中，内含1%BSA和 0.1% I型胶原酶,37笆消化60 min,消化期间每间隔5 min 上下振荡1次。

加入含15%胎牛血清的DMEM F12培养基终止消化1.2.3 SVF 处理1.2.3. 1分离80目（75 Um）网筛过滤组织消化液, 去除未消化残余组织将滤液移入新的10 mL离心管，1800 r/min离心10 min,可见离心管内液体分为4层先吸除表层的脂滴和次层乳状的成熟脂肪细胞，再吸弃第3层上清液 体，留下底层沉淀物SVFO加入含15%胎牛血清的DMEM F12 培养基1 mL吹打重悬，计数1.2. 3.2接种培养 在25 cm培养瓶中预先置入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基3 mL,覆盖培养瓶底将重悬的SVF细胞悬液移入培养瓶，细胞密度为20 000 cm-2o培养 瓶置37笆、体积分数为0. 05的C02培养箱培养6 h后换 液，去除未贴壁细胞此后每3天更换1次培养基1.2. 3.3传代 约1周后，细胞融合达到70%〜80%时， 可以传代吸弃上清培养液，用含0. 02%EDTA的0. 25%胰蛋白 酶消化液浸润1遍，吸弃，倒置相差显微镜下观察见细胞回缩, 间隙增大，吸弃消化液即加入含15%胎牛血清的DMEM F12培 养基终止消化，吸管轻柔吹打脱壁移入10 mL离心管，1 800 r/min离心5 min,弃上清，加入含15%胎牛血清的DMEM F12 培养基1 mL重悬。

第2代细胞用于免疫荧光组织化学染色 鉴定1.2. 3.4鉴定采用免疫荧光组织化学染色鉴定SVF 细胞接种于24孔板内L多聚赖氨酸预包被的盖玻片上，用 于免疫荧光组织化学染色鉴定室温下,37笆预热的PBS洗 去培养基,4%多聚甲醛固定30 min.PBS漂洗5 minX3次 加入0. l%Triton X溶液，室温作用30 min, PBS洗涤5 min 正常4%BSA于37 C封闭20 min分别加入CD31、CD34山 羊源性单克隆抗体（CD31检测内皮细胞,CD34检测干细胞）， 置4笆冰箱孵育过夜PBS冲洗5 minX3次,加入猴抗山羊 FITC二抗,37 C作用45 min,PBS液漂洗5 minX3次荧光 显微镜下拍照观察以PBS取代一抗为阴性对照1.3结果（1）细胞形态学接种后细胞在6 h内大 部分贴1,24-48 h贴壁牢固相差显微镜下，最初为小圆形, 细胞大小不等，核浆比较大2〜4d后可见细胞伸展,核呈椭 圆形，较大，之间混有少数形态、体积不一的细胞绝大部分 细胞的生长呈现明显的聚集性（图1）原代细胞约1周左右 可以达到70%〜80%融合常规传代后，第2代以后的细胞约 4 d左右即可以达到70%〜80%融合。

2）免疫细胞学第2 代脂肪SVF约有70%细胞呈CD31阴性.CD34阳性，表明具有 干细胞的特性（图2）SVF：脂肪基质血管组分.A：接种6 h首次换液后第1 代SVF,细胞贴壁，多呈小圆形，大小不等,核浆比较大；B：接 种48 h后第1代SVF,细胞较明显伸展；C：第2代SVF,细胞 形态均匀,呈聚集性生长；D：第2代SVF,生长至70%〜80%融 合.图1人SVF细胞形态（略）Fig 1 The morphology of cultured human SVF cells 2讨论从脂肪组织中去除成熟脂肪细胞后获得的具有干细 胞特性的基质细胞，有不同的名称由于其中除了有具干细 胞特性的细胞外，可能还含有少许其他成分的细胞，是一种 混合细胞群笔者认为将这种细胞群称为SVF更为适合研 究表明，这种细胞具有很强的自我增殖能力[2]在特定条件 下，除了可以分化为脂肪细胞外，脂肪间充质干细胞还可以 诱导分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞，以及肝细胞、 胰岛细胞、神经元样细胞、心肌样细胞和血管内皮细胞等 [3 4]o对于SVF的细胞免疫表型，有不少研究进行了探索 [3 6]笔者选择细胞未分化标志CD34和内皮细胞标志CD31 作为SVF鉴定的细胞表型指标，结果表明CD34阳性、CD31阴 性。

不可忽视的是，部分学者对其中某些SVF细胞表型包括 CD34得出的结果不同，但获得的细胞同样具有多向分化潜能[7] o有研究发现,SVF细胞随着传代,CD34表达呈下降趋势 而被检测的SVF所传的代数不同，可能是不同研究出现某些 SVF表型不同的原因之一[8]目前,体外分离培养SVF的方法主要为酶消化法胰 蛋白酶容易破坏细胞膜上的膜蛋白，损伤细胞胶原酶主要 针对细胞间质的胶原，而对细胞影响较小鉴于组织取材于 皮下脂肪，笔者选择I型胶原酶，消化中加入BSA以进一步降 低对细胞的损伤由于脂肪组织以及成熟脂肪细胞会浮于消 化液上部，造成实际作用于脂肪组织间质的胶原酶浓度快速 降低，因此消化液的体积与脂肪组织的体积的比例要 >；2：L成熟脂肪组织容易破裂，释放出的游离脂肪酸等 物质有一定的细胞毒作用[9 10],可能会对SVF的培养产生 不利影响，因此，轻柔的上下振荡，尽可能减少脂肪细胞的破 裂鉴于0.2%的I型胶原酶作用较强,本研究采用了 0.1%的 I型胶原酶消化60 min的方法消化后所获得的细胞数较 多，细胞损伤较小成熟脂肪细胞与SVF脂滴含量相差大,SVF 离心沉淀，与漂浮于培养液上部的成熟脂肪细胞及少许脂滴 自然分层。

接种至培养瓶前,预置培养液覆盖瓶底，再移入离 心重悬的SVF,可避免少许残余的成熟脂肪细胞或脂滴粘附 于干燥的瓶底而混杂于SVF中SVF细胞的生长呈现一定的 聚集性另外,通过塑料培养瓶贴壁法培养，红细胞等其他细 胞通过换液传代逐渐去除，避免了应用氯化氨等红细胞裂解 液对目的细胞可能的损伤SVF原代接种6h左右，基本贴壁, 延长首次换液时间对SVF的纯度无益SVF：脂肪基质血管组分.左：免疫荧光检测，右：同视 野可见光相差显微镜图.A：PBS空白对照，细胞未见荧光; B：CD34抗原阳性，主要表达在细胞质及细胞膜，细胞核不表 达；C：CD31抗原阴性，细胞未见荧光.图2人SVF细胞鉴定（免疫荧光组织化学染色）（略）Fig 2 Immunofluorescence assay of human SVF cells 【参考文献】[1] Corre J,Barreau C,Cousin B, et al. Human subcutaneous adipose cells support complete differentiation but not self renewal of hematopoietic progenitors[J]. J Cell Physiol, 2006,208（2）:282 288.[2] Lee R H,Kim B,Choi I, et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J]. Cell PhysiolBiochem, 2004,14(4 6):311 324.[3] Planat Benard V,Silvestre J S,Cousin B,et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells： physiological and therapeutic perspectives[J]. Circulation, 2004,109(5):656 663.[4] Varma M J, Breuls R G, Schouten T E, et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue derived stem cells [J]. Stem C。