WB操作步骤.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑WB操作步骤 操作步骤 （一） 蛋白样品制备 （1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上举行）收集细胞，加裂解液100ul漩涡混匀，冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存 （二） 蛋白含量的测定 （1） 制作标准曲线 1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温溶解后，备用 2、 取适量的蛋白标准稀释至终浓度0.5 mg/ml ； 按照下表将0.5mg/ml BSA和稀释液PBS加到96孔板中，并取样品2ul参与96孔板中，加PBS至20ul.（样品和标准品均设置复孔） 3、 按A:B=50:1配制适量的BCA工作液，混匀，室温24h内稳定 各孔参与200ulBCA工作液37°30min后，测定A562，求平均值，绘制标准曲线 编号 1 0.5mg/ml BSA (ul) PBS(ul) 2 1 19 3 2 18 4 4 16 0.1 5 8 12 0.2 6 12 8 0.3 7 16 4 0.4 8 20 0 0.5 0 20 得到标准BSA浓度 (ug\%ul) 0 0.025 0.05 （三） SDS－PAGE电泳 电泳时间一般为2～3h，电压为80V 30min;120V 3h较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，举行转膜。

SDS-PAGE 分开胶浓度 6% 8% 10% 最正确分开范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD 12% 15% 12-60kD 10-40kD ? 配制10%的过硫酸铵 ? 配制12%分开胶（5ml) ? 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候中断灌胶，参与蒸馏水 ? 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水 ? 配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 ? 插上梳子，聚合20分钟 ? 留神：灌胶过程中制止产生气泡 （四）转膜 转膜细致操作过程： （1）转一张膜需打定6张7.0～8.0cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜切滤纸和膜 时确定要戴手套，由于手上的蛋白会污染膜PVDF膜那么在M-OH中浸泡10min以上后转入TBS液中平衡将滤纸浸入TBS液中润湿 （2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜 （3）将夹子开启使黑的一面保持水平在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡一手擀另一手要压住垫子使其不能随意移动在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬撬一会儿玻璃板便开头松动，直到撬去玻板（撬时确定要提防，玻板很易裂）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要制止把分开胶刮破轻轻划开分开胶与玻板左右两边的接触面，不然取胶时轻易弄破提防剥下分开胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡（膜盖下后不成再移动）在膜上盖3张滤纸并除去气泡结果盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子整个操作在转膜液中举行，要不断的擀去气泡膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路留神膜在正极+侧，分开胶在负极-侧标记正反面转移液含甲醇，操作时要戴手套，测验室要开门以使空气流通） （5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温湿转一般用400mA转移1:30 h，根据分子量大小调整 转移方法的选择： ? 半干转 ? ? ? ? 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h ? 湿转 ? 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法； ? ? ? 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h （五）免疫回响 （1）封闭： 转完后将膜用去离子水或TBST从下向上浸湿后吸干，将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)的平皿中，室温下封闭1h。

（2）一抗孵育： 将一抗用一抗稀释液或TBST稀释至适当浓度（在15ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于测验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min本测验室用封膜机将膜蛋白密封) （3）二抗孵育： 同上方法打定二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，举行化学发光回响 （六）化学发光，显影，定影 （1）将A和B两种试剂在EP管中等体积混合；1min后，将此混合液充分涂抹在膜蛋白面上；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中 （2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；开启X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开头计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间屡屡压片，以达最正确效果；曝光完成后，开启X-光片夹，取出X-光片，急速浸入显影液中显影，待展现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影终止后，连忙把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片通明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干 应留神的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否那么会对结果产生影响 （七） 凝胶图象分析 将胶片举行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值 — 6 —。