弱精子症精子线粒体DNA A3 243G，G3 316A和T3 394C突变的检测.doc

1弱精子症精子线粒体 DNA A3 243G，G3 316A和 T3 394C 突变的检测作者：凌雪梅 方可欣，楼哲丰，张巍，张李雅，金龙金【摘要 】 　　目的：检测弱精子症精子线粒体 tRNAleu 3 243位点、线粒体 ND1 3 316 位点和 3 394 位点碱基突变频率，分析三个位点突变与弱精子症的相关性方法 ：按 WHO 标准随机收集了 69 例弱精子症患者精子标本和 60 例正常人正常活动力精子标本，以聚合酶链反应、ApaⅠ和 HaeⅢ限制性内切酶长度多态性分析和测序检测 mtDNA A3 243G、G3 316A 和 T3 394C 三个位点的突变，比较两组突变频率的差异分析 G3 316A 和 T3 394C 突变的氨基酸变异情况并结合生物信息学工具分析错义突变氨基酸进化保守性结果：弱精子症精子 mtDNA G3 316A 突变率（4.35%） 、T3 394C 突变率（2.90%）和总突变率（7.25%）与正常对照组（分别为 5.00%、1.67%和 6.67%）比较，差异无显著性氨基酸变异分析发现，G3 316A（Ala->Thr ） 、T3 394C（Tyr->His）均为错义突变，其中 T3 394C 突变位点所编码的氨基酸在人、牛、小鼠、爪蟾 4 种生物中进化具有高度保守性。

结论： G3 316A 和 T3 394C 突变可能不是影响人类精子活动力的主要因素 【关键词】 弱精子症 mtDNA 突变2Abstract: Objective: To detect the mutation frequencies at the locis of mtDNA 3 243，3316 and 3 394 in sperms and asthenospermia， to analyze the correlationship between the mutation asthenospermia at three loci. Methods: After 69 asthenospermia cases and 60 control cases were collected under the WHO criterion，the point mutations of mtDNA 3 243， 3316 and 3 394 in sperms was detected using PCR-RFLP (polymerase chain reaction and restriction endonuclease fragment length polymorphism) with ApaⅠand HaeⅢ and sequencing. Mutation rate of asthenospermia group were compared to control group. The amino acids evolution conservation of the missense mutation sites were also analyzed by bioinformatics tools. Results ：The results of mutation frenquency (G3 316A 4.35%，T3 394C 2.90%，total 7.25%) in asthenospermia group showed no significant differences compared with control group (5%，1.67% and 6.67%). G3 316A （Ala-Thr）and T3 394C （Tyr-His） were missence mutations．Of whem，the amino acid of the nt3 394 sites was highly conserved in four species that have different evolution levels．Conclusion: These mutations of G3 316A and T3 394C in human sperm may be not enough to 3induce the decreasing of the motality of sperm.Key words: asthenospermia；mtDNA ；mutation按 WHO 推荐，夫妇同居 1 年以上，未采用任何避孕措施，由于男方原因造成的女方不孕者，称为男性不育。

据 WHO 统计，大约有 10%～15%的已婚夫妇不育，且男方不育因素约占 50%[1]在男性不育症中，部分表现为精子活动力低下（a 级精子<25%且 a+b 级精子<50%） ，称为弱精子症[2]精子运动需要能量供应，已知线粒体是细胞的能量代谢中心，但线粒体在弱精子症发生中的作用还不精楚nt3 243 位点位于 tRNAleu(UUR)基因，Spiropoulos[3]等对一名有线粒体 A3 243G 突变男性精子进行分析，认为突变的程度和精子活动力降低关系密切但是 Huang 等[4]指出一些携带 A3 243G 突变者也可有正常的精子活动力nt3 316和 nt3 394 位于 mtND1 基因，季敬璋等 [5]对 2 型糖尿病患者 G3 316A 和 T3 394C 突变进行检测，前者与对照组比差异具有显著性而后者差异无显著性；但 G3 316A 和 T3 394C 突变与弱精子症的关系尚鲜见报道为了探索弱精子症与 mtDNA 突变的相关性，进而探讨弱精子症的分子病因，我们对弱精子症 mtDNA A3 243G、G3 316A 和 T3 394C 突变进行了检测1 材料和方法 41.1 研究对象 弱精子症精液标本来自本校附属第一医院生殖医学中心，按照 WHO 精液参数标准，选取精子活力低下（a<25%且a+b<50%）者 69 例，精子活动力正常组 60 例。

所有标本采集前禁欲 3 d 以上，手淫法采集标本，于 37 °C 液化 20～30 min1.2 主要试剂 PCR 扩增引物依据文献[5]设计，上游引物序列：5’-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3’ ，下游引物序列：5’-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3’，扩增 nt3 153～3 551 区域399 bp引物由宝生物工程（大连）有限公司合成限制性内切酶Hae III、Apa I 为 Fermentas 公司产品PCR 反应试剂盒、DNA片断纯化试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品1.3 方法1.3.1 精子 mtDNA 提取：精液液化标本用 PBS 洗涤 2～3次，沉淀加 200～500 μL 消化液(200 mmol/L Tris-HCl，400 mg/L 蛋白酶 K，15 μmol/L DTT，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA)，于 56 °C 消化过夜，酚- 氯仿抽提，乙醇沉淀1.3.2 PCR 反应和产物鉴定：2.5 μL DNA 模板，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各 0.3μL，2.5μL dNTP(2.5 mmol/L)，1.5 5μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 10×PCR 缓冲液，0.1 μL Taq 酶，补充 dd H2O 至 25 μL。

反应体系在 94 °C 预变性 5 min，按 94 °C 变性 30 s，58 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min 程序共循环 35次，最后于 72 °C 终末延伸 7 min，扩增产物用 1.6%琼脂糖电泳鉴定1.3.3 PCR 产物的纯化和限制性内切酶酶切：按宝生物工程（大连）有限公司 DNA 片断纯化试剂盒说明书操作纯化 PCR 产物，纯化后的 PCR 产物分别用 Hae III、Apa I 两种限制性内切酶消化，消化反应体系和反应条件按说明书操作，消化后的产物用 0.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，数码照相1.3.4 序列测定：经 PCR-PFLP 筛查出有突变的标本， PCR产物经纯化后送上海基康生物技术有限公司进行正向测序1.4 数据分析1.4.1 序列比对：测序返回结果用 Gentle 软件与 Mitomap数据库(www.mitomap.org)上提供的人类线粒体剑桥序列进行比对，发现可疑的变异位点后用 ChormasPro 软件读取测序结果峰图进一步确认1.4.2 突变位点的氨基酸变异分析：对筛查到的 2 个突变位6点在 Mitomap 数据库中查找相应氨基酸改变情况，并分析突变位点的氨基酸进化保守性。

1.5 统计学处理方法 组间突变率的比较采用卡方检验2 结果2.1 PCR 扩增结果 69 例弱精子症和 60 例正常对照精子DNA 标本全部扩增出特异性条带扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示与预期产物片段大小一致（见图 1） 2.2 PCR-RFLP 和测序检测突变结果 将 PCR 产物分别用Hae III、Apa I 酶切消化后，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，突变标本经测序证实，共检测出 G3 316A 和 T3 394C 两种突变（见表1，图 2、3） ，G3 316A、T3 394C 和合计突变率在两组间比较差异无显著性两组标本未检测到 A3 243G 突变2.3 G3 316A，T3 394C 突变的氨基酸变异和进化保守性分析 G3 316A，T3 394C 突变均为错义突变，突变前后氨基酸改变和突变位点的氨基酸进化保守性（见表 2）分析显示 nt 3 394 位点所编码的氨基酸在所分析的人、牛、小鼠和爪蟾 4 种生物中具有高度进化保守性73 讨论精子的运动功能或运动能力的强弱直接关系到能否受精，只有一定数量的快速前向运动的精子才能确保精子抵达输卵管壶腹部与卵子结合成受精卵ATP 是精子活力的重要能源，获能后的精子通过氧化磷酸化产生大量 ATP，精子出现一种特异的 “鞭打样”运动方式，通过此种方式，精子穿过卵子透明带而受精。

如果精子能量代谢障碍，精子就可能产生活力降低和受精能力的下降，产生生殖障碍Holyoake 等[6] 发现 2 个最常见的线粒体基因位点 9055和 11719 在低活动力精子中突变率显著提高，与精子活动力相关我们对弱精症 mtATPase6 基因突变研究显示，mtATPase6 具有进化保守性位点的累计错义突变频率显著高于对照组，认为这些位点突变可能与弱精子症有关[7]但是，国内外对弱精子症的线粒体基因突变研究尚少见，还没有明确的证据证明哪些突变是导致精子活动力下降的原因ND1 基因表达的蛋白质是组成线粒体呼吸链和氧化磷酸化代谢酶复合体Ⅰ的一个亚单位，即 NADH 脱氢酶单位 1，该蛋白是线粒体 DNA 编码的 13 个蛋白质亚单位之一 nt3 316 位于 mtND1 蛋白的 N 端第 4 个氨基酸，正常情况下该密码子编码丙氨酸，G3 316A 突变可导致 ND1 亚单位上第 4 位疏水性氨基酸丙氨酸变成亲水性氨基酸苏氨酸nt3 394 位于 mtND1 蛋白的 N 端第 30 个氨基酸，正常情况下该密码子编码酪氨酸， T3 394C 突变8使亲水性的中性氨基酸酪氨酸变为亲水性的碱性氨基酸组氨酸。

有研究报道，这 2 个位点突变与 2 型糖尿病相关 [8]氨基酸保守性分析显示，nt3 394 位点编码的氨基酸在人、小鼠、牛、爪蟾 4 种生物中具有高度进化保守性，且 nt3 316 和 nt3 394 突变均位于ND1 的保守区刘松梅等[8]认为，nt3 316 和 nt3 394 这 2 个位点的突变引起疏水性氨基酸到亲水性氨基酸和中性氨基酸到碱性氨基酸的改变，使 NADH 脱氢酶亚单位 1 的二级结构。