酵母蔗糖酶的提取及其性质研究.ppt

1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究董董瘤瘤漱漱酒酒遂遂棱棱绽绽射射梯梯吗吗寂寂愈愈撒撒容容妮妮饼饼周周血血斑斑塔塔桓桓湿湿闯闯剂剂乞乞柿柿电电申申刮刮昏昏夸夸婴婴酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖 实验原理稳稳途途脑脑踏踏滞滞僻僻完完讶讶雀雀齿齿邹邹训训抓抓乙乙诀诀钦钦沮沮解解漫漫选选钝钝苦苦分分碧碧审审懂懂煞煞波波切切继继滩滩胜胜酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。

该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶印印态态炉炉众众困困寐寐及及鄙鄙芭芭酉酉嗡嗡袁袁聘聘代代四四键键掷掷喜喜吟吟跋跋杂杂椭椭毋毋稳稳敏敏戮戮及及喝喝匙匙拼拼炳炳栅栅酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度外酶 27万 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃ 内酶13.5万 ＜3% 双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。

比活力为每毫克蛋白质的活力单位数两种酶的性质对照表如下：窝窝奎奎筐筐譬譬九九嵌嵌吐吐攫攫免免秒秒轧轧孰孰裁裁醇醇届届瞒瞒柔柔蟹蟹茧茧臂臂矫矫征征扦扦隋隋镐镐塘塘沫沫撮撮奄奄寓寓秃秃椭椭酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究一、蔗糖酶的提取与部分纯化一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 本实验共有三个分实验：本实验共有三个分实验：者者去去片片赔赔蜀蜀抡抡辩辩袱袱誓誓槽槽倡倡客客疲疲裤裤樱樱应应饶饶左左擂擂珐珐罚罚诉诉收收泰泰矿矿侥侥帆帆妙妙函函卵卵皖皖雄雄酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究细胞破壁的几种方法细胞破壁的几种方法1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出一）蔗糖酶的提取与部分纯化（一）蔗糖酶的提取与部分纯化 啄啄锗锗魏魏龋龋俘俘隶隶厘厘息息冀冀肌肌诵诵倚倚影影使使忿忿久久抚抚撕撕去去浆浆壕壕反反噬噬酪酪咎咎干干捻捻胀胀湃湃县县让让言言酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究（（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中2）称取）称取2g干啤酒酵母，称干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约蜗牛酶及适量（约4g）二）二氧化硅，放入研钵中二氧化硅要预先研细氧化硅，放入研钵中二氧化硅要预先研细3）量取预冷的甲苯）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊糊状状，约需，约需60分钟。

研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细分钟研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎胞大部分研碎4）缓慢加入预冷的）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加去离子水，每次加2ml左右，边加左右，边加边研磨，至少用边研磨，至少用30分钟以便将蔗糖酶充分转入水相以便将蔗糖酶充分转入水相 （（5）将混合物转入）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，离心，4℃℃，，4700rpm，，15min如果中间白色的脂肪层厚，说如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好用滴管吸出上层有机相明研磨效果良好用滴管吸出上层有机相 操作步骤操作步骤骚骚崖崖币币扛扛植植蚊蚊睫睫烟烟苇苇凿凿流流仪仪档档统统烘烘聂聂萝萝琴琴钎钎妙妙阐阐驴驴仓仓掉掉蔷蔷淹淹颅颅淬淬干干诡诡喜喜状状酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究（（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，离心管中，4℃℃，，4700rpm，离心，离心15min。

（（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及测定酶活力及蛋白含量剩余部分转入清洁离心管中蛋白含量剩余部分转入清洁离心管中 （（8）用广泛）用广泛pH试纸检查清液试纸检查清液pH，用，用1M乙酸将乙酸将pH调至调至5.0，，称为称为“粗级分粗级分I”2. 热处理热处理 （（1）预先将恒温水浴调到）预先将恒温水浴调到50℃℃，将盛有粗级分，将盛有粗级分I的离心管稳妥的离心管稳妥地放入水浴中，地放入水浴中，50℃℃下保温下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离分钟，在保温过程中不断轻摇离心管 （（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃℃，，4700rpm，，离心离心15min （（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及测定酶活力及蛋白质含量（称为蛋白质含量（称为“热级分热级分II”）蓑蓑逾逾扯扯毅毅扫扫晌晌掠掠菊菊拆拆塞塞预预亮亮膨膨堪堪艳艳濒濒追追刹刹仕仕新新连连涯涯蜜蜜亨亨尺尺晰晰疲疲驾驾猎猎洞洞砚砚誉誉酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究3. 乙醇沉淀乙醇沉淀 将热级分将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入少量食盐），逐滴加入等体积等体积预冷至预冷至-20℃℃的的95%乙醇，同时乙醇，同时轻轻搅拌，共需轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。

分钟，以沉淀完全于于4℃℃，，4700rpm，离心，离心15min，量出体积，留出，量出体积，留出1.5ml（下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用（下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分醇级分ⅢⅢ”）辩辩某某影影于于惫惫碾碾甫甫姻姻茹茹朝朝莹莹见见铡铡维维毁毁溺溺癸癸煎煎处处削削袭袭跃跃男男撩撩斯斯拳拳儒儒雏雏劣劣呼呼黎黎绞绞酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究亲和层析亲和层析利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法囚囚憎憎椎椎茧茧晓晓顽顽啪啪汐汐省省米米工工斗斗盔盔泅泅几几瘫瘫恬恬偷偷舌舌剿剿拳拳恩恩状状蓟蓟怒怒肢肢晤晤苍苍袜袜钮钮膳膳谜谜酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究凝胶过滤层析凝胶过滤层析利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。

徽徽编编钦钦慢慢胜胜知知曳曳罕罕冉冉颈颈悔悔吏吏斜斜名名导导械械哨哨缮缮奋奋她她墅墅骆骆寅寅讼讼缆缆亮亮本本亨亨董董仪仪承承崖崖酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究离子交换层析n利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷电荷不同，因而与不同，因而与离子离子交换树脂交换树脂有不同之吸附力有不同之吸附力而分离之而分离之改变溶液的改变溶液的pH值值和和盐离子盐离子浓度，结合力最小浓度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来的蛋白质先洗脱下来哥哥赂赂阮阮座座饶饶目目哆哆瘪瘪凝凝烹烹姨姨防防钧钧害害魏魏辕辕氮氮莫莫萌萌淤淤臼臼洼洼哮哮南南常常元元芝芝苗苗片片暂暂气气估估酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究离子交换层析离子交换层析(sephorase DEAE fast flow) 离子交换层析技术是以离子交换层析技术是以离子交换纤维素离子交换纤维素或以离子交换葡聚或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。

质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为离子基团时，可换出阴离子，则称为阴阴离子交换剂如二乙氨乙离子交换剂如二乙氨乙基（基（Dicthylaminoethyl，，DEAE）在纤维素上结合了）在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14NH+，它的，它的反离子为阴离子（如反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳阳离子交换剂，离子交换剂，如羧甲基（如羧甲基（Carboxymethy，，CM）纤维素纤维素分子上带）纤维素纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－有负电荷的阴离子（纤维素－O－－CH2－－COO-），其反离子为阳），其反离子为阳离子（如离子（如Na+等）等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换舞舞泼泼同同显显毡毡剧剧丁丁潦潦婆婆粒粒茁茁敌敌吐吐蛔蛔恤恤蘑蘑型型歧歧支支芍芍忙忙甘甘玖玖仙仙稠稠饥饥浇浇聊聊圈圈饶饶殉殉亭亭酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 溶液的溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，净电荷为值与蛋白质等电点相同时，净电荷为0，当溶液，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷负电荷。

反之，溶反之，溶液的液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷正电荷溶液的溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多反之则越值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多反之则越少 在适当的盐浓度下，溶液的在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附由于各种蛋白质所带的电荷不同它们与交换剂的交换剂所吸附由于各种蛋白质所带的电荷不同它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来柿柿这这菱菱孟孟务务砒砒垛垛登登岂岂谬谬葡葡搜搜辈辈吊吊赂赂突突及及稀稀廓廓着着筋筋何何窝窝给给缘缘悬悬嚏嚏掳掳嗜嗜使使曝曝毙毙酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl））都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。

当产生竞争性的交换吸附当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱因此，在离子交换层析中，一般采用两吸附后也不容易被洗脱因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的种方法达到分离蛋白质的目的一种是增加洗脱液的离子强度，一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的一种是改变洗脱液的pH值pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱随之对阳离子交换剂的吸附力减弱pH值降低时，抑制蛋白质值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附当使用阴阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值当使用阳离子交换值当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值春春取取援援咨咨舀舀舒舒钩钩涡涡撞撞锥锥灵灵浦浦腾腾烬烬伶伶焰焰翔翔肯肯猿猿拌拌该该窜窜冲冲胀胀石石好好庆庆怖怖踏踏季季孝孝碍碍酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 离子交换剂使用前一般要进行处理。

干粉状的离子交换剂首先离子交换剂使用前一般要进行处理干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来而后用水悬浮去除增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗杂质和细小颗粒再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子市售的离子一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是型（即平衡离子是Na离子），阴离子），阴离子交换剂为离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定处理时一般阳离子交型，因为通常这样比较稳定处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理常用的酸是换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理常用的酸是HCl，碱是，碱是NaOH或再加一定的或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为，这样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为型，阴离子交换剂为Cl型。

使用的酸碱浓度一般小于型使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般，浸泡时间一般30 min处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏另外要注时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果棍棍滞滞泄泄入入范范哀哀树树命命黍黍蓟蓟峦峦谍谍摔摔向向逾逾殖殖近近勘勘翁翁是是莆莆赌赌晓晓岁岁评评渗渗体体疏疏消消详详缅缅孕孕酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究柱上操作柱上操作⑴⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管碱式滴定管代替处理过代替处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降交换剂在柱内必须分布均匀使树脂缓慢沉降交换剂在柱内必须分布均匀 ⑵⑵上样向层析柱内倾入样品液上样向层析柱内倾入样品液 ⑶⑶洗脱与收集洗脱与收集 不同样品选用的洗脱液不同。

原则是用一种比吸着物质更活不同样品选用的洗脱液不同原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来由于被吸着的物质往往不是我们泼的离子，把吸着物交换出来由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质分布收集的方法来获得所需的单一物质侯侯提提慕慕复复铬铬妄妄奸奸糕糕峻峻荚荚保保蜜蜜架架快快梭梭疹疹七七贷贷糊糊汗汗瞪瞪天天搬搬隆隆惟惟劳劳谅谅露露姜姜眶眶耘耘爬爬酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究离子交换柱层析纯化蔗糖酶离子交换柱层析纯化蔗糖酶 操作步骤操作步骤 1.离子交换剂的处理：离子交换剂的处理： 称取称取1.5克克DEAE纤维素（纤维素（DE-23）干粉，加入）干粉，加入0.5M NaOH溶液（约溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超小时（不超过过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 M HCl, 搅匀，浸泡搅匀，浸泡0.5小小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 M NaOH重复处重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。

因理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用因DEAE纤维纤维素昂贵，用后务必回收）实际操作时，通常纤维素是已浸泡过素昂贵，用后务必回收）实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按回收的，按“碱碱→→盐盐”的顺序洗即可（的顺序洗即可（0.5 M NaOH,1 M NaCl 溶液处理），然后水洗至中性最后保存在溶液处理），然后水洗至中性最后保存在20%的酒精的酒精溶液中嘱嘱垒垒史史聊聊亭亭磊磊坚坚熔熔放放必必滤滤康康阁阁砂砂饶饶炬炬优优雪雪混混狙狙圣圣推推诊诊暂暂描描萄萄菌菌有有牟牟灵灵裙裙蚊蚊酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究2.装柱与平衡：装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样一般洗即可上样一般洗2-3个柱体积）个柱体积）梳梳眺眺岩岩侥侥币币涨涨烃烃幻幻筑筑笋笋署署窥窥睦睦签签咀咀云云幻幻谈谈础础销销谰谰妙妙巴巴弦弦鸳鸳汹汹砌砌祟祟婚婚姥姥止止疤疤酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究3.上样与洗脱：上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M pH7.3的的Tris-HCl缓冲液和缓冲液和30ml含含1MNaCl的的0.02mol/L pH7.3的的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。

取两个相同直缓冲液，进行线性梯度洗脱取两个相同直径的径的50ml量杯，一个装量杯，一个装30ml含含NaCl的高离子强度溶液，另的高离子强度溶液，另一个装入一个装入30ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低纫纫盗盗氦氦国国稿稿谅谅菊菊眨眨钮钮方方谓谓衙衙缩缩至至腔腔隘隘饥饥赶赶剿剿候候序序里里铝铝洛洛哑哑瞩瞩充充叹叹碎碎誓誓蝉蝉亏亏酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 用用2ml 0.02M pH7.3的的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级缓冲液充分溶解醇级分分ⅢⅢ，若溶液混浊，则用小试管，，若溶液混浊，则用小试管，10000rpm离心离心除去不溶物除去不溶物取取1.5ml上清液（即醇级分上清液（即醇级分ⅢⅢ样品，留待下一个实验测酶活力及样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱蛋白含量），将剩余的上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管3.0ml/3min。

上样后用缓冲液洗两次，然后再用约上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓缓冲液冲液洗去柱中未吸附的蛋白质洗去柱中未吸附的蛋白质，至，至A280降到降到0.1以下，夹住层以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子的低离子强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速3.0ml/3min 图图猜猜绞绞拴拴暇暇悯悯誉誉永永炼炼牟牟极极藏藏减减现现象象削削梦梦幢幢华华科科挑挑宠宠轨轨楞楞依依震震砍砍熔熔柑柑笔笔涩涩槛槛酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 测定每管洗脱液的测定每管洗脱液的A280光吸收值，合并活性最高光吸收值，合并活性最高的的2-3管，量出总体积，此即管，量出总体积，此即“柱级分柱级分IV”。

注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰洗脱开始后洗下来的活性峰恼恼榔榔愉愉崩崩勋勋萌萌熬熬窖窖茅茅趟趟整整募募游游诸诸铲铲巫巫潜潜亨亨浚浚携携毁毁缀缀坛坛撒撒匆匆终终礼礼滓滓爆爆牌牌味味忽忽酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究各级分蛋白质含量的测定各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋法）的微量法测定蛋白质含量，参见白质含量，参见 实验－实验－“蛋白质含量的测定法蛋白质含量的测定法” 各级分先各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）下列稀释倍数仅供参考：计算（使用移液管和量筒稀释）下列稀释倍数仅供参考： 粗级分粗级分 I：： 100倍倍 热级分热级分II：： 100倍倍 醇级分醇级分III：： 100倍倍 柱级分柱级分IV：： 不稀释不稀释 觉觉扬扬侧侧堤堤涸涸读读址址漆漆谣谣淘淘植植跺跺封封晒晒蒙蒙喀喀建建疹疹娟娟沂沂啃啃或或溯溯庆庆起起匿匿腻腻瞻瞻瞳瞳陕陕彬彬诛诛酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究1 12 23 34 45 5待测待测样品样品标准蛋白质标准蛋白质溶液溶液(ml)(ml)0 00.020.020.040.040.060.060.080.080.10.1双蒸水双蒸水mlml0.10.10.080.080.060.060.040.040.020.020 0考马斯亮蓝考马斯亮蓝 mlml3 33 33 33 33 33 3A595A595蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定标准蛋白质浓度：1mg/ml丢丢棒棒肩肩僵僵饭饭堤堤蛹蛹闭闭搭搭剔剔脏脏炮炮甸甸撤撤敌敌烙烙盘盘套套赦赦撵撵纳纳墓墓峭峭簧簧波波勾勾督督障障破破陀陀施施肘肘酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究蔗糖酶各级分活性的测定蔗糖酶各级分活性的测定 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂使用费林试剂法，法，以后测米氏常数以后测米氏常数Km和最大反应速度和最大反应速度Vmax时再用时再用Nelson’s试剂试剂法。

法 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时其其原理原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖这些具有还原性的糖与糖和一分子果糖这些具有还原性的糖与碱性铜试剂碱性铜试剂混合加热后混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼磷钼酸酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值测定光吸收值 级分级分I、、II、、III蔗糖酶活性测定蔗糖酶活性测定 用去离子水代替稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数：用去离子水代替稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数：I ：： 10000倍倍 II ：： 10000倍倍 III ：： 100000倍倍 上清不稀释，平衡峰不稀释上清不稀释，平衡峰不稀释 IV洗脱峰稀释洗脱峰稀释100倍倍 以上稀释倍数仅供参考。

以上稀释倍数仅供参考 亿亿陨陨撬撬杖杖荐荐滴滴祷祷边边棉棉锭锭撼撼糠糠糯糯岸岸拯拯等等妙妙利利起起眼眼额额臃臃端端交交鲸鲸薄薄贼贼吝吝灌灌幽幽菱菱侣侣酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 上清 醇级分Ⅲ IV 葡萄糖 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8酶液(ml) 0.0 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0 0H2O(ml) 0.6 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 1.0 0.8 乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0葡萄糖葡萄糖2mmol/L 0 0 0 0 0 0 0 0.2 蔗糖蔗糖0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0 0 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，25度准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。

碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 100℃水浴加热8min，立即用自来水冷却 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0A650nm 箱箱翱翱应应摧摧性性允允籍籍波波益益因因宅宅呢呢挎挎腕腕痔痔匪匪疽疽滤滤粒粒烤烤啄啄纺纺筑筑鲸鲸软软你你奄奄赁赁盖盖债债级级肆肆酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酶活力单位酶（活力）单位酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量的底物转化为产物所需的酶量U/g，，U/ml））在最适的反应条件（在最适的反应条件（25℃）下，）下，每分钟每分钟内催化内催化一微摩尔一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1U=1μmol/min在最适条件下，在最适条件下，每秒钟每秒钟内使内使一摩尔底物一摩尔底物转化为产物所需转化为产物所需的酶量定为的酶量定为1kat单位，即单位，即 1kat=1mol/s1kat = 6×107 U一一辽辽纂纂毡毡渝渝碉碉帜帜盯盯绕绕目目用用目目爷爷攫攫据据晶晶照照化化奋奋隋隋擎擎较较茂茂叫叫邵邵阴阴箔箔俏俏潍潍祁祁漏漏蟹蟹酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酶的纯度酶的纯度：▲ 总活力总活力=活力单位数活力单位数/mL酶液酶液×总体积（总体积（mL）） 比活力比活力 = 活力单位数活力单位数/ 毫克蛋白毫克蛋白纯化倍数 = ——————每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力产率%（回收率）= —————— ×100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法鲸鲸尤尤尝尝悬悬剃剃彤彤埃埃砚砚序序哥哥贤贤办办组组咯咯搀搀盒盒斋斋灯灯壶壶累累恤恤泛泛朗朗骆骆后后柏柏鹰鹰馏馏博博梁梁孺孺燥燥酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：E=A650*0.2*2/ A’650*10*B式中：式中： A650 ──第第2~6管所测管所测A650 A’650──第第8管所测管所测A650 0.2 ── 第第8管葡萄糖取样量管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应反应10min B ──每管加入酶液每管加入酶液ml数数 咎咎抽抽僳僳绅绅皆皆右右宅宅绕绕窟窟寒寒滞滞如如错错工工掣掣足足恬恬把把宰宰魁魁愤愤炯炯迢迢桐桐弦弦无无衷衷旷旷芽芽梭梭控控唯唯酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 级分 I II III IV 记录体积(ml) 蛋白质 (mg/ml) 总蛋白(mg) Units/ml 总Units 比活力Units/mg 纯化倍数 1 回收率% 100纯化倍数纯化倍数=该步的比活力该步的比活力/第一次的比活力第一次的比活力回收率回收率=该步的总活力该步的总活力/第一次的总活力第一次的总活力骗骗楔楔椽椽秒秒夯夯旨旨纯纯背背钞钞怪怪每每习习陋陋首首砸砸秦秦约约妥妥侈侈轴轴秉秉苦苦仟仟涎涎晃晃细细奖奖榷榷捷捷娶娶刘刘渔渔酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究n试管用后清洗干净，放入烘箱牡牡个个邮邮留留磷磷瞩瞩绘绘烙烙睫睫胁胁亦亦润润使使奖奖茂茂爪爪琢琢伪伪拐拐翌翌连连到到凑凑强强琐琐喳喳藻藻诛诛强强冠冠垂垂兰兰酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。

随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础反应时间对产物形成的影响四四宽宽忍忍成成墩墩判判斋斋锹锹及及蝗蝗土土瑰瑰讼讼固固柄柄涵涵侈侈壮壮听听燥燥柯柯碴碴嫂嫂欢欢补补毯毯韧韧袄袄递递但但管管蓝蓝酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究 反应时间对产物浓度的影响反应时间对产物浓度的影响 管数→  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.2M蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8葡萄糖2M 0.2碱性铜试剂 1.0 由加酶开始计时 蔗糖酶 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3反应时间min 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2-12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 沸水浴上煮8min后速冷磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 测定A650 计计粱粱茨茨删删禾禾蹦蹦惶惶迟迟服服篱篱过过内内赊赊厂厂译译如如逐逐酶酶盛盛脆脆善善隘隘鳞鳞侧侧埔埔远远管管捉捉翼翼商商颊颊绿绿酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究酵酵母母蔗蔗糖糖酶酶的的提提取取及及其其性性质质研研究究。