生物被膜初始黏附调控机制及其在食品品质控制中的应用研究进展.docx

    生物被膜初始黏附调控机制及其在食品品质控制中的应用研究进展    熊儒恒，阎 俊，谢 晶（上海海洋大学食品学院，农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）细菌是影响食品品质的主要因素[1]，其通过自身代谢作用，产生初级或次级代谢产物，使得食品基质发生劣变，形成挥发性有机物等有害物质，进而影响食品风味和食品安全性，导致食品安全问题的发生[2-4]细菌在自然界中有两种生存模式[5]：浮游态和生物被膜态，其中生物被膜态是细菌细胞在自然界中普遍且主要的存在形式生物被膜是细菌细胞黏附于物体表面后，自身分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS），并将细菌细胞包裹其中而形成的菌体聚集膜状物[6]EPS主要包括胞外蛋白、胞外多糖、核酸、脂质等胞外大分子以及其他生物分子等[7]，它能使细菌固定在物体表面并形成稳定的微生物群落，维持生物被膜结构生物被膜的形成增强了细菌细胞的代谢能力[8]、环境耐受性[9]等，赋予了细菌复杂的代谢功能，增强了细菌的持续感染力、毒力以及耐药性等[7,10]。

生物被膜的生命周期分为4 个阶段：初始黏附、微菌落形成、生物被膜成熟和生物被膜降解[11]初始黏附是浮游态细菌通过细菌表面元器件、EPS等作用与物体表面产生一系列理化作用并吸附到生物或非生物表面的过程[12]细菌初始黏附分为可逆黏附和不可逆黏附两个阶段在可逆黏附阶段，浮游态细菌首先在重力、布朗运动以及自身鞭毛和菌毛[13-14]等作用下到达生物或非生物界面，在界面环境的影响下，细菌细胞表面物质逐渐发生构象变化，并在液体流速[15]、黏附介质等外界因素[16]的影响下，与界面表面分子产生分子间作用力或静电引力等理化作用，发生可逆黏附作用同时，细菌细胞将胞外基质的受力变化和环境变化等信号传导到细胞内，激活细菌特异性基因的表达，如细菌外排泵基因的激活[17]等，促进细菌发生不可逆黏附作用细菌发生不可逆黏附后，其EPS如胞外多糖等能进一步增强细菌与外界接触表面的不可逆黏附[8,18-19]，并最终使细菌完成初始黏附过程[20]细菌经不可逆黏附过程完成初始黏附后，才能顺利形成生物被膜[20]初始黏附是细菌形成生物被膜过程中的重要阶段，也是细菌能否形成生物被膜的决定性阶段细菌初始黏附受到多种因素的影响，其中细菌细胞内的调控系统是影响其初始黏附的重要因素。

环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）、双组分调控系统和群体感应系统是细菌细胞中常见的调控系统[21]c-di-GMP是细菌细胞中常见的第二信使分子，其含量变化会影响细菌EPS如胞外多糖和胞外蛋白的合成和分泌，以及细菌鞭毛的迁移率，导致细菌黏附性发生变化，并最终影响细菌的初始黏附作用[19,22]；双组分调控系统是细菌细胞常见的调控系统，其能根据细菌细胞外界环境如营养物质水平等的变化，通过磷酸化等化学反应调节细菌细胞中基因的转录水平，并影响细菌初始黏附等生命活动[23-24]；群体感应系统是细菌由于群体密度增加，在细菌细胞与细胞之间产生的一种调控系统群体感应系统对细菌细胞的调控作用主要通过细菌分泌的群体感应信号分子实现，细菌细胞可以通过感受自身细胞或其他细菌细胞分泌的群体感应信号分子的种类和浓度，调节自身初始黏附作用和生物被膜的形成[25]c-di-GMP、双组分调控系统和群体感应系统等调控系统的存在能帮助细菌感知和应答外界环境信号，是影响细菌发生初始黏附作用、形成生物被膜，并最终影响食品品质和安全的重要因素因此，研究不同调控系统对细菌初始黏附作用的调控十分有必要。

本文阐述并分析了c-di-GMP、双组分调控系统和群体感应系统3 种调控系统（图1）对细菌初始黏附的调控作用及其作用机制，并对从控制初始黏附角度进行食品品质控制的应用进行了总结和展望本文可为控制细菌造成的食品品质危害提供一定的理论依据，有助于生物被膜靶向控制技术的开发，对食品产业的发展具有一定意义图1 细菌调控系统Fig.1 Bacterial regulatory system1 c-di-GMP调控系统c-di-GMP是在1987年由Ross等[26]于木糖醋杆菌（Acetobacter xylinum）中首次发现的一种化合物随着研究的深入，c-di-GMP在细菌尤其是革兰氏阴性菌中的调控作用得到越来越多的关注c-di-GMP的合成和降解分别在二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase，DGC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDE）的催化作用下进行[27]，编码DGC和PDE的基因在细菌细胞中广泛存在[27]光照[28]、氧气[29]和温度[30]等外界环境条件可通过调控DGC和PDE编码基因的表达来调节细菌细胞中DGC和PDE的表达水平，进而影响细菌体内c-di-GMP的含量。

细菌体内c-di-GMP含量的变化对调节细菌生理代谢有十分重要的作用一般情况下，细菌细胞内c-di-GMP含量较高时，细菌倾向于生物被膜态；当细菌细胞内c-di-GMP含量较低时，细菌倾向于浮游态[31]c-di-GMP调控细菌下游表型的方式分为3 种：c-di-GMP作为核糖开关，结合mRNA在核糖体上的结合位点，调节mRNA的转录和翻译[32-33]；c-di-GMP的受体蛋白为转录因子，与转录因子结合，调控转录因子对基因转录的调控能力，从而调控下游靶基因的表达[34-35]；c-di-GMP的受体蛋白为激活/阻遏蛋白，与受体蛋白结合，通过调控靶蛋白的活性来影响细菌生命活动[36-37]，其中c-di-GMP作为核糖开关调控下游表型的现象较少，目前仅在艰难梭菌（Clostridium difficile）中被发现[32-33]通过结合转录因子直接调控下游细菌基因的表达，以及通过调节靶蛋白活性以调控细菌代谢等生命活动的两种调控方式，是c-di-GMP调控细菌初始黏附和生物被膜形成的主要方式c-di-GMP在细菌初始黏附过程中起到了不可忽视的作用在细菌初始黏附阶段，c-di-GMP先通过调节细菌元器件如鞭毛的合成、控制鞭毛转动速度等调节细菌菌体接触外界固体表面，并选择性调节EPS组分如胞外蛋白和胞外多糖的合成和分泌基因的表达，促进细菌细胞黏附在外界固体表面[19,36-37]。

c-di-GMP能够调控多数EPS组分的合成和分泌，这是其调控细菌初始黏附的重要方式1.1 c-di-GMP对胞外多糖的影响胞外多糖是EPS的重要组成部分，在细菌初始黏附、生物被膜的形成和成熟过程中发挥了重要作用，并能增强细菌对宿主的浸染力以及环境耐受性[5]胞外多糖的结构、流变学和热力学特性受到温度和pH值等多种因素的影响[38]，且不同胞外多糖的理化性质也有很大差异[38-39]细菌能产生多种形式的胞外多糖，常见的有纤维素、聚-N-乙酰葡萄糖胺、海藻酸盐、Psl多糖和Pel多糖等[40-41]其中，c-di-GMP通过调控Pel和Psl多糖的合成和分泌来调控细菌初始黏附作用受到了研究人员的广泛关注Pel是一种阳离子胞外多糖[42]，它的合成和转运由pelA～G操纵子编码的蛋白质负责[43-44]Pel多糖的合成和转运过程如图2A所示，PelD、PelE、PelF和PelG在细菌细胞内或内膜上形成复合物，该复合物负责Pel多糖前体的合成和转运；Pel多糖前体在PelE的协助下经过内膜到达周质空间，再经PelA的去乙酰化修饰后形成Pel多糖；最后，Pel多糖在PelC和PelA的帮助下经过PelB穿过外膜后输出到细菌细胞表面发挥作用[43,45]。

图2 细菌胞外多糖合成和转运Fig.2 Synthesis and transport of bacteria extracellular polysaccharidesc-di-GMP能通过多种方式影响细菌胞外多糖Pel的合成和转运，进而调控细菌的初始黏附早期的研究发现，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中存在一种结合蛋白FleQ，该蛋白能抑制pel基因的表达，影响细菌的初始黏附当细菌中c-di-GMP水平升高时，c-di-GMP与FleQ结合，并解除后者对pelA基因转录的抑制作用，促进Pel多糖的正常合成和分泌[46]同时，近一步的研究表明，在c-di-GMP水平升高的情况下，细菌细胞中pelA基因的转录水平也相应升高，细菌黏附能力和形成生物被膜的能力也得到加强[41]c-di-GMP对Pel多糖的直接调控体现在对Pel多糖合成基因pelD转录产物的调控上研究人员发现，在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的Pel多糖合成基因中，pelD基因能直接接受c-di-GMP的调控，作为c-di-GMP的效应蛋白，pelD转录蛋白上含有环状核苷酸受体和GGDEF结构组成的双结构域，这个结构有助于pelD转录蛋白和c-di-GMP结合形成复合物，该复合物能有效促进Pel多糖的合成和分泌，并促进细菌的初始黏附[47-48]。

c-di-GMP对Pel多糖的影响通过多种形式进行，这也是c-di-GMP通过影响Pel合成和分泌，进而调控细菌初始黏附，从而应对复杂多变的外部环境的一种有效形式与Pel不同的是，Psl是一种中性的细菌胞外多糖[49]Psl的合成和转运由Psl胞外多糖生物合成系统负责[50]，该系统是一个包含12 个基因（pslA～L）的psl操纵子，Psl胞外多糖的合成和转运如图2B所示，dTDP-鼠李糖等Psl多糖合成原料经PslB作用后，通过PslI、PslH、PslF和PslC等转移糖基形成Psl多糖单元，其由内膜蛋白PslA提供结合位点，在结合位点的帮助下，Psl多糖单元被组装到细胞质的类异戊二烯脂质上，然后在PslJ、PslK和PslL等内膜蛋白的作用下经过聚合作用形成Psl多糖，并在PslE协助下穿过细胞内膜，随后在PslG的帮助下穿过周质空间，并经PslD转运到细胞膜外[50]Psl有助于增强细菌黏附作用，促进细菌附着于宿主细胞表面[51-52]此外，Psl能够通过增强细胞黏附作用增加细菌毒性，对菌株有一定的保护作用[53]c-di-GMP通过影响Psl多糖的编码基因来影响Psl合成和转运。

研究表明，当细菌细胞中c-di-GMP水平升高时，细菌中pslA基因的转录水平也相应升高，从而增强了细菌的初始黏附和抗药性等作用[41,54]研究人员在对铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的研究中发现，当鸟苷酸环化酶SadC在细菌中过表达时，铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）细胞外Psl的产量显著增加，这一促进作用可能与SadC结构中的跨膜结构域有关，其虽然不会影响c-di-GMP的合成，但却对Psl的形成和分泌有调控作用[55]此外，Psl可诱导DGC如SiaD和SadC的合成，提高细菌细胞内c-di-GMP的水平，实现正反馈调节[56]目前，关于c-di-GMP调控Psl合成和分泌的研究还比较少，c-di-GMP调控Psl操纵子的作用还需要进一步研究1.2 c-di-GMP对胞外蛋白的影响胞外蛋白作为生物被膜的主要成分之一，在细菌初始黏附和生物被膜形成过程中也起到重要的作用黏附蛋白是细菌胞外蛋白的组分之一，c-di-GMP不仅影响细菌胞外多糖的合成和分泌，也能调控细菌黏附蛋白的合成，并通过影响胞外蛋白的黏附作用调控细菌的初始黏附[57]目前，研究人员已在不同的菌种中发现多种黏附蛋白[58-59]，其中，c-di-GMP调控BpfA和LapA蛋白并影响细菌初始黏附的作用机理是研究人员关注的热点。

BpfA 蛋白最初是在奥奈达希瓦氏菌M R-1（Shewanella oneidensisMR-1）中发现的，该蛋白的分子质量为。