第六章兽药残留检测技术激素类课件.ppt

第六章 兽药残留检测技术第八节第八节 激素类药物残留的危害分激素类药物残留的危害分析与检测方法析与检测方法 一、概述一、概述l兽用激素包括兽用激素包括皮质激素皮质激素、、同化激素同化激素l天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松这类皮质激天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松这类皮质激素有较强的糖代谢及抗炎等作用素有较强的糖代谢及抗炎等作用,而对水、盐代谢的作用而对水、盐代谢的作用较弱较弱,所以称其为所以称其为糖皮质激素糖皮质激素临床上应用广泛临床上应用广泛通常所说的皮质激素即指这类激素说的皮质激素即指这类激素l近年来近年来,为了提高疗效为了提高疗效,降低副作用降低副作用,而而合成合成了一系列的了一系列的糖糖皮质激素衍生物皮质激素衍生物如泼尼松泼尼松(强的松强的松)与氢化泼尼松与氢化泼尼松(强的强的松龙松龙),糖原异生作用更强糖原异生作用更强,对水盐平衡的影响更弱较小对水盐平衡的影响更弱较小剂量常用于补充肾上腺皮质功能缺乏剂量常用于补充肾上腺皮质功能缺乏,较大剂量则能抑制较大剂量则能抑制免疫过程中的多个环节，缓解炎症免疫过程中的多个环节，缓解炎症1、糖皮质激素、糖皮质激素l糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激的反应性的反应性,具体表现在具体表现在抗炎抗炎、、免疫抑制免疫抑制、、抗毒素抗毒素和和抗休克抗休克等等方面。

还可使血糖升高方面还可使血糖升高,蛋白质分解加强蛋白质分解加强,使血淋巴细胞、使血淋巴细胞、嗜酸性细胞减少嗜酸性细胞减少,红细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等红细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等l糖皮质激素主要用于以下疾病糖皮质激素主要用于以下疾病:各种炎症、严重感染及传各种炎症、严重感染及传染病、过敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产染病、过敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产l皮质激素会引起水皮质激素会引起水分在体内滞留分在体内滞留,增加肉的重量增加肉的重量,因而因而在畜在畜牧业中有可能当作牧业中有可能当作增重剂增重剂而被滥用而被滥用l滥用这类药物后滥用这类药物后,肉品感官上多汁、肉瘦肉品感官上多汁、肉瘦因此饲养场中用因此饲养场中用皮质激素作皮质激素作催长剂催长剂，属于，属于违禁使用违禁使用泼尼松泼尼松l别名强的松别名强的松,不溶于水不溶于水,微溶于乙醇微溶于乙醇应避光、密封保应避光、密封保存l具有具有抗炎抗炎及及抗过敏抗过敏作用作用,还能还能促进蛋白质分解转变为糖促进蛋白质分解转变为糖,减少葡萄糖的利用减少葡萄糖的利用,因而使血糖及肝糖原增加因而使血糖及肝糖原增加,尿中可尿中可出现糖尿出现糖尿,同时同时增加胃液分泌增加胃液分泌,促进食欲促进食欲。

l其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小,抗炎及抗抗炎及抗过敏作用较强过敏作用较强,副作用较小副作用较小,故故比较常用比较常用l主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、风湿、类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上风湿、类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上腺皮质功能不足症、湿疹等腺皮质功能不足症、湿疹等地塞米松地塞米松l别名氟美松别名氟美松,不溶于水不溶于水,溶于无水乙醇溶于无水乙醇应遮光保存应遮光保存l抗炎抗炎及及控制皮肤过敏控制皮肤过敏的作用比泼尼松龙更显著的作用比泼尼松龙更显著,而对水、而对水、钠潴留和促进钾排泄作用较弱钠潴留和促进钾排泄作用较弱l目前地塞米松的应用愈来愈广泛目前地塞米松的应用愈来愈广泛,有取代泼尼松等其他合有取代泼尼松等其他合成皮质激素的趋势成皮质激素的趋势l肌注后吸收快肌注后吸收快,狗和鼠分别于狗和鼠分别于0.5h和和6h达血药峰浓度达血药峰浓度大大部分在肝内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而部分在肝内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而灭活氟轻松氟轻松l氟轻松为白色结晶性粉末氟轻松为白色结晶性粉末,无臭无臭,不溶于水不溶于水,溶于乙醇溶于乙醇。

应应遮光、密封保存遮光、密封保存l氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一种种,涂敷于局部对皮肤、黏膜的炎症涂敷于局部对皮肤、黏膜的炎症(搔痒及皮肤过敏反搔痒及皮肤过敏反应等有效不但疗效高应等有效不但疗效高,而且显效快而且显效快,使用很低浓度即有使用很低浓度即有明显作用明显作用,止痒作用尤其突出止痒作用尤其突出l本品主要用于各种本品主要用于各种皮肤病皮肤病,如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等对局部化脓创面痒等对局部化脓创面,需同时配合新霉素等抗生素需同时配合新霉素等抗生素倍他米松倍他米松l倍他米松为白色结晶性粉末倍他米松为白色结晶性粉末,无臭无臭,味苦味苦,几乎不溶于水几乎不溶于水,溶于溶于乙醇乙醇l本品含有多种盐类本品含有多种盐类,如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等均如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等均应遮光保存应遮光保存l内服吸收良好内服吸收良好,生物利用度约为生物利用度约为72%,血浆蛋白结合率血浆蛋白结合率64%,半衰期半衰期5.6h,4.8%的药量自尿液排出的药量自尿液排出l牛肌注牛肌注80µg/kg,停药二日停药二日,肝脏中母药残留量为肝脏中母药残留量为5.4~7.8µg/kg; 停药八日停药八日,肝脏中母药残留量为肝脏中母药残留量为10.9µg/kg,肾肾脏、肌肉和脂肪中母药残留量分别为脏、肌肉和脂肪中母药残留量分别为2.3µg/kg、、3.9µg/kg和和4.4µg/kg。

2、同化激素、同化激素l例如：例如：雄激素雄激素能明显地促进蛋白质合成能明显地促进蛋白质合成(同化作用同化作用),能使能使肌肉发达肌肉发达,体重增加体重增加;同时氨基酸分解减少同时氨基酸分解减少(异化作用异化作用),使使尿素生成减少降低氮质血症但使用雄激素常可出现尿素生成减少降低氮质血症但使用雄激素常可出现男男性化现象性化现象,因而限制了它的应用因而限制了它的应用l近年来人工合成的一些衍生物近年来人工合成的一些衍生物,其雄激素作用大为减弱其雄激素作用大为减弱,而同化作用则保留或增强而同化作用则保留或增强,这些衍生物称这些衍生物称同化激素同化激素l同化激素同化激素主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和损失过多等情况损失过多等情况l畜牧业中使用同化激素畜牧业中使用同化激素(非治疗用途，提高胴体品质、非治疗用途，提高胴体品质、增重和提高饲料转化率增重和提高饲料转化率),可以很快产生显著和直接的经可以很快产生显著和直接的经济效益济效益,因此对生产者有很大的吸引力因此对生产者有很大的吸引力同化激素类药物同化激素类药物l去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮、去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮、氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮、诺甲醋孕酮、美仑孕酮、醋酸甲地孕酮、诺甲醋孕酮、去甲睾酮、司坦唑醇、醋酸群勃龙等去甲睾酮、司坦唑醇、醋酸群勃龙等醋酸甲羟孕酮醋酸甲羟孕酮l作用与黄体酮相似作用与黄体酮相似,孕激素活性强孕激素活性强,无雌激素和雄激素活无雌激素和雄激素活性性,有抗雌激素作用。

有抗雌激素作用l内服、注射均有效内服、注射均有效内服在胃肠道吸收内服在胃肠道吸收,在肝内降解肌在肝内降解肌内注射后内注射后2~3天血药浓度达到峰值血药峰值越高天血药浓度达到峰值血药峰值越高,药物药物清除越快清除越快肌注肌注150mg后后6~9个月血中才检不出药物个月血中才检不出药物l小牛肌注复方制剂小牛肌注复方制剂(24mg醋酸甲羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、100mg苯甲酸苯甲酸雌二醇、雌二醇、200mg癸酸去甲睾酮癸酸去甲睾酮)后停药后停药2天天,血浆中醋酸甲血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为羟孕酮浓度为1µg/kg,14天时降至天时降至30pg/kg尿液在数天尿液在数天内都能检出内都能检出,14天时醋酸甲羟孕酮浓度为天时醋酸甲羟孕酮浓度为37pg/kg肾肾组组织残留相对较高织残留相对较高,故作为残留检测的靶组织故作为残留检测的靶组织醋酸美仑孕酮醋酸美仑孕酮l别名醋酸甲烯雌醇别名醋酸甲烯雌醇,为合成的避孕药为合成的避孕药l内服时孕激素作用约为黄体酮的内服时孕激素作用约为黄体酮的75倍倍,无雌激素和雄激素无雌激素和雄激素活性活性,具有显著排卵抑制作用具有显著排卵抑制作用l小母牛小母牛用药后用药后,母药和代谢物主要由粪便排出母药和代谢物主要由粪便排出。

停药停药6h,肝、脂肪、肾和肌肉组织中的残留量分别为肝、脂肪、肾和肌肉组织中的残留量分别为9~15µg/kg、、7~8µg//kg、、1.2~1.8µg/kg和和0.5~1µg/kg脂肪脂肪、肝、肾、肝、肾和肌肉中母药残留量分别占总残留的和肌肉中母药残留量分别占总残留的80%、、37%、、30%和和45%l美国美国FDA规定规定休药期休药期48h,但欧盟禁止使用但欧盟禁止使用去甲睾酮去甲睾酮l牛牛注射注射去甲睾酮后去甲睾酮后,脂肪中残留能被检出脂肪中残留能被检出,并持续并持续73天天;尿中残留低于尿中残留低于1µg/kgl内服内服后脂肪中残留未被检出后脂肪中残留未被检出,但尿中残留可检出但尿中残留可检出醋酸甲地孕酮醋酸甲地孕酮l本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用制作用,但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱不具有雌激但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱不具有雌激素和雄激素样活性素和雄激素样活性,但有明显抗雌激素作用与雌激但有明显抗雌激素作用与雌激素合用素合用,抑制排卵抑制排卵l动物致畸试验表明对家兔具有动物致畸试验表明对家兔具有死胎率增加死胎率增加和和致畸致畸作作用。

用l口服口服后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短,大部分代大部分代谢产物以谢产物以葡萄糖醛酸酯葡萄糖醛酸酯形式排出形式排出3、危害、危害l对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素(包括雌酮、包括雌酮、雌二醇、睾酮、皮质酮等物质雌二醇、睾酮、皮质酮等物质)及及β2-受体激动剂受体激动剂(苯乙胺苯乙胺类类)这些存在于环境介质中的激素量虽然很小这些存在于环境介质中的激素量虽然很小,但大多但大多具有具有生物富集生物富集作用作用,容易通过食物链在人体中富集容易通过食物链在人体中富集,对人对人类及其他生物产生极其严重的危害类及其他生物产生极其严重的危害l主要产生各种主要产生各种慢性慢性、、蓄积性毒性蓄积性毒性,如致癌、致畸、致突变如致癌、致畸、致突变等三致性毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等等三致性毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等β2-受体激动剂类药物可产生急性毒性作用受体激动剂类药物可产生急性毒性作用l危害多具有危害多具有隐蔽性隐蔽性,易造成实质性危害而易造成实质性危害而难以逆转难以逆转糖皮质激素的危害糖皮质激素的危害l对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能,使使肾上腺肾上腺皮质萎缩皮质萎缩。

l另外另外,过多摄入过多摄入,可使人产生可使人产生多毛症多毛症、、满月脸满月脸以及以及免疫力免疫力下降下降等毒副作用等毒副作用l对敏感型的个体可造成血管扩张对敏感型的个体可造成血管扩张,血压降低而引起血压降低而引起休克休克,甚至甚至死亡死亡同化激素的危害同化激素的危害l目前目前,同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注l长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会导致机体代谢紊乱、导致机体代谢紊乱、发育异常发育异常,且多数激素类物质具有且多数激素类物质具有潜在的致癌作用潜在的致癌作用l欧盟欧盟(原欧洲经济共同体原欧洲经济共同体)从从1988年起年起,禁止所有同化激素用于禁止所有同化激素用于动物的促生长目的动物的促生长目的,并制定了严格的监测措施并制定了严格的监测措施l我国从我国从20世纪世纪90年代起年代起,也陆续开始对用于促生长目的的同也陆续开始对用于促生长目的的同化激素禁止使用化激素禁止使用,并已开展了相关的监测工作并已开展了相关的监测工作l但是但是,在利益驱动下在利益驱动下,在世界范围内在世界范围内,同化激素仍在被大量滥用同化激素仍在被大量滥用。

就残留的危害和引起的争议而言就残留的危害和引起的争议而言,同化激素同化激素与与抗生素抗生素并列为并列为最重要的兽药残留最重要的兽药残留雄性激素及其同化激素的危害雄性激素及其同化激素的危害l进人人体和动物体后进人人体和动物体后,对其生殖功能产生严重的影响对其生殖功能产生严重的影响,甚甚至可能造成某些物种的绝种至可能造成某些物种的绝种l通过食物链进行富集通过食物链进行富集,在人体首先引起内分泌失调在人体首先引起内分泌失调,危害危害生殖系统生殖系统,易出现生殖器病变易出现生殖器病变l对男性的危害：对男性的危害：表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝肾功能障碍或肝脏肿瘤肾功能障碍或肝脏肿瘤l对女性的危害：对女性的危害：可引起女性的不孕、早产、流产、月经可引起女性的不孕、早产、流产、月经不调或女性男性化不调或女性男性化(肌肉增生、毛发增多肌肉增生、毛发增多)等现象l目前目前,在局部地区已开始出现在局部地区已开始出现人类生存危机人类生存危机现象现象,如发达如发达国家约有国家约有20%的家庭没有子女的家庭没有子女,而睾丸癌的患者明显增加而睾丸癌的患者明显增加对其他动物的危害对其他动物的危害l激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著,如鱼、如鱼、鸟和哺乳动物的大量死亡鸟和哺乳动物的大量死亡,雌雄异变雌雄异变,生育和发育紊生育和发育紊乱乱,免疫力下降等现象免疫力下降等现象,可能均与此有关。

可能均与此有关l1980年左右年左右,美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼雄性化雄性化,且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾,原来正常雄性鱼出现超雄化原来正常雄性鱼出现超雄化,并表现为攻击性交尾行并表现为攻击性交尾行动l在日本在日本,发现有雌海螺长有雄海螺的生殖器发现有雌海螺长有雄海螺的生殖器雌性激素的危害雌性激素的危害l雌性激素造成的环境污染雌性激素造成的环境污染,同样可能造成某些物种的绝同样可能造成某些物种的绝种l通过食物链产生的富集作用通过食物链产生的富集作用,可引起人体的可引起人体的内分泌失调内分泌失调,l对男性的危害：对男性的危害：使男性精子数量下降或出现女性化、使男性精子数量下降或出现女性化、性早熟、抑制骨骼发育等性早熟、抑制骨骼发育等l对女性的危害：可引起女性对女性的危害：可引起女性 性早熟、生殖器官畸形和性早熟、生殖器官畸形和癌变癌变,这一效应在其女性后代中表现更显著这一效应在其女性后代中表现更显著l对人类后代的危害：对人类后代的危害：这些激素透过胎盘这些激素透过胎盘,可引起用药者可引起用药者子宫内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子宫内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子发育不良、生殖器畸形。

子发育不良、生殖器畸形对其他动物的危害对其他动物的危害l雌性激素的污染对人类之外的其他动物雌性激素的污染对人类之外的其他动物,同样有着严重的同样有着严重的影响l美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出现期出现卵巢异常卵巢异常、南极企鹅产下、南极企鹅产下无精卵无精卵以及其他一些连以及其他一些连体、体、畸形动物畸形动物的较高比例出现的较高比例出现,可能均与环境激素污染有可能均与环境激素污染有关二、样品处理二、样品处理（一）（一）皮质激素皮质激素的样品处理的样品处理（二）（二）同化激素同化激素的样品处理的样品处理（一）皮质激素（一）皮质激素1、皮质激素样品预处理、皮质激素样品预处理l液体样品液体样品(奶、血液、尿液奶、血液、尿液)提取前需要提取前需要脱脂肪脱脂肪,通常在通常在4℃ 、、7000g离心离心,除去浮在上层的脂肪除去浮在上层的脂肪l组织样品组织样品(肌肉、肝、肾肌肉、肝、肾)先要用切碎机或匀浆器进行先要用切碎机或匀浆器进行组组织破碎织破碎水或醋酸盐缓冲液常用于水或醋酸盐缓冲液常用于样品的稀释样品的稀释l肝脏或尿样肝脏或尿样中的皮质激素结合物较多中的皮质激素结合物较多,因此先用因此先用葡糖苷酸葡糖苷酸酶酶/硫酸酯酶水解硫酸酯酶水解。

l由于酶解反应较慢由于酶解反应较慢,为保证水解完全为保证水解完全,可在较高的温度下可在较高的温度下来加速水解或延长孵育时间来加速水解或延长孵育时间l用超临界萃取法提取时用超临界萃取法提取时,先要将组织样品匀浆先要将组织样品匀浆,再进行冷再进行冷冻干燥2、提取皮质激素、提取皮质激素l在一定的在一定的pH值条件下值条件下,一般用一般用有机溶剂有机溶剂对样品对样品提取和除提取和除蛋白蛋白l例如例如,氯仿氯仿提取牛奶中的氢化可的松提取牛奶中的氢化可的松;l二氯甲烷二氯甲烷-正己烷正己烷(4+1)提取牛奶中游离的氢化可的松和提取牛奶中游离的氢化可的松和21-醋酸酯醋酸酯;l乙酸乙酯乙酸乙酯提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙、倍他米松氟羟强的松龙、倍他米松,牛奶中的甲基强的松龙，牛奶牛奶中的甲基强的松龙，牛奶中的氢化波尼松和地塞米松中的氢化波尼松和地塞米松;l含含0.1mol/L氢氧化钠的乙酸乙酯氢氧化钠的乙酸乙酯提取牛组织中的地塞米提取牛组织中的地塞米松松;有机溶剂法提取有机溶剂法提取l甲醇甲醇提取牛肉组织中的提取牛肉组织中的5种皮质激素种皮质激素;l乙腈乙腈提取牛肝脏中的提取牛肝脏中的5种人工合成的皮质激素和牛组织种人工合成的皮质激素和牛组织中的地塞米松中的地塞米松;l乙醚乙醚提取牛粪中提取牛粪中9种合成的皮质激素种合成的皮质激素;l二氯甲烷二氯甲烷提取动物脂肪中的氟强的松龙提取动物脂肪中的氟强的松龙;l丙酮丙酮提取动物肝脏提取动物肝脏(肾脏和肌肉中的氟强的松龙。

肾脏和肌肉中的氟强的松龙l此外此外,牛奶牛奶和和尿样尿样可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提取3、净化、净化l粗提取液中含大量的粗提取液中含大量的内源性干扰物质内源性干扰物质,为了消除或降低干为了消除或降低干扰并浓缩分析物扰并浓缩分析物,样液需要净化处理样液需要净化处理l净化方法净化方法包括液包括液-液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及柱切换技术等柱切换技术等l液液-液萃取液萃取可以简单的一次溶剂萃取可以简单的一次溶剂萃取,也可以多次溶剂萃也可以多次溶剂萃取萃取次数的多少取萃取次数的多少,很大程度上取决于色谱的分离效率很大程度上取决于色谱的分离效率和选择性和选择性l色谱的分离度和选择性愈高色谱的分离度和选择性愈高,样品的提取和净化步骤可以样品的提取和净化步骤可以简略一些简略一些,还可以提高分析效率还可以提高分析效率液液-液萃取法液萃取法l液液-液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质l例如例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松的松的乙酸乙酯提取液乙酸乙酯提取液,依次用依次用稀酸溶液稀酸溶液和和稀碱溶液洗涤稀碱溶液洗涤,可以可以除去除去碱性和酸性的碱性和酸性的水溶性杂质水溶性杂质。

l地塞米松的地塞米松的乙酸乙酯提取液乙酸乙酯提取液,可以可以用氢氧化钠溶液洗涤用氢氧化钠溶液洗涤,以除去酚类雌激素以除去酚类雌激素l甲基强的松龙的初提液蒸发至干后甲基强的松龙的初提液蒸发至干后,用用乙腈溶解乙腈溶解,加入加入正正已烷已烷提取提取,正已烷提取液再用正已烷提取液再用饱和的硫酸钠水溶液饱和的硫酸钠水溶液提取提取,最后用最后用二氯甲烷二氯甲烷提取l氟强的松龙提取液蒸发至干后氟强的松龙提取液蒸发至干后,依次用依次用乙腈乙腈和和正己烷正己烷,正正己烷己烷和和水水进行液进行液-液萃取液萃取,最后用最后用二氯甲烷二氯甲烷提取l通过液通过液-液萃取对分析物的提纯液萃取对分析物的提纯,可以降低仪器检测的背可以降低仪器检测的背景干扰景干扰,大大提高分析方法的检测灵敏度大大提高分析方法的检测灵敏度l皮质激素的初提液还可通过皮质激素的初提液还可通过三相液三相液-液分配净化：液分配净化：l当组织样用当组织样用乙腈乙腈水溶液初提后水溶液初提后,上清液加入上清液加入正己烷正己烷和和二氯二氯甲烷甲烷,进行进行乙腈乙腈、、正己烷正己烷和和二氯甲烷二氯甲烷的三相液的三相液-液萃取液萃取,非非极性组分被分配到正己烷相中极性组分被分配到正己烷相中,极性和离子化组分被分配极性和离子化组分被分配到底层水相中到底层水相中,皮质激素和其他中等极性组分则分配到中皮质激素和其他中等极性组分则分配到中间乙腈相中。

间乙腈相中固相萃取法固相萃取法l采用有机溶剂萃取法容易出现采用有机溶剂萃取法容易出现乳化乳化现象现象,因而常常导致提因而常常导致提取回收率偏低或不稳定取回收率偏低或不稳定l固相萃取法固相萃取法克服了这一缺点克服了这一缺点,且具有操作简便、快速的优且具有操作简便、快速的优点l常用的固相萃取柱吸附剂有常用的固相萃取柱吸附剂有C18、、C8和弗洛里硅藻土和弗洛里硅藻土(Florisil)等l例如例如,C18固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质激素净化激素净化,血浆或血清样品中氢化可的松净化血浆或血清样品中氢化可的松净化lFlorisil柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的松龙净化松龙净化免疫亲和柱色谱法免疫亲和柱色谱法l免疫亲和柱具有高的专一性免疫亲和柱具有高的专一性,近年来发展迅速近年来发展迅速,已应用于已应用于皮质激素的生物样品制备皮质激素的生物样品制备l例如例如,用两种抗体结合的免疫亲和柱用两种抗体结合的免疫亲和柱,可以分离纯化肝、可以分离纯化肝、牛奶、尿样和粪样中牛奶、尿样和粪样中9种皮质激素。

种皮质激素l免疫亲和色谱与免疫亲和色谱与GC-负离子化学电离质谱负离子化学电离质谱联用联用,已用于马已用于马组织中双氟美松的确证分析组织中双氟美松的确证分析柱切换技术柱切换技术l柱切换技术自动化程度高柱切换技术自动化程度高,浓缩浓缩和和纯化纯化,大大大大简化了样品的前处理步骤简化了样品的前处理步骤l例如例如,牛组织中地塞米松测定时牛组织中地塞米松测定时,样液经苯基柱初样液经苯基柱初级分离后流至硅胶预富集柱中级分离后流至硅胶预富集柱中,通过柱切换通过柱切换,改变改变流动相将富集柱中的待测物洗脱至氰丙基分析流动相将富集柱中的待测物洗脱至氰丙基分析柱中分离柱中分离超临界超临界CO2流体萃取法流体萃取法l超临界超临界CO2流体萃取法具有低温、快速、无溶剂流体萃取法具有低温、快速、无溶剂萃取的优点萃取的优点l例如例如,超临界流体萃取法与超临界流体萃取法与HPLC联用联用,用于牛组用于牛组织中地塞米松残留的测定织中地塞米松残留的测定（二）同化激素的样品处理（二）同化激素的样品处理1、样品预处理：、样品预处理：l液体样品液体样品(尿、血浆、胆汁、牛奶尿、血浆、胆汁、牛奶)在提取前在提取前,可可用水或磷酸盐缓冲液用水或磷酸盐缓冲液稀释稀释。

l半固体样品半固体样品(肌肉、肝、肾肌肉、肝、肾)在提取前需要在提取前需要均质均质l脂肪样脂肪样可在可在40~60℃ 下下加热加热,使脂肪融化成液体使脂肪融化成液体2、提取、提取l生物样品中生物样品中游离游离的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿腈、碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇甲醇等等有机溶剂提取有机溶剂提取l激素结合物激素结合物的的水溶性较大水溶性较大,不易被有机溶剂提取不易被有机溶剂提取,可先可先将样品将样品水解水解后再提取游离激素后再提取游离激素l常用的水解方法有常用的水解方法有酶水解酶水解和和碱水解碱水解两种l酶水解通常使用酶水解通常使用葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶,前者可专前者可专一地水解葡糖苷酸结合物一地水解葡糖苷酸结合物,后者可水解硫酸酯结合物后者可水解硫酸酯结合物l由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物,常使用常使用葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶芳基硫酸酯混合酶,控制控制pH4.5~7.0,于于37℃ 温育过夜温育过夜。

l碱水解碱水解通常使用氢氧化钠溶液通常使用氢氧化钠溶液,由于合成类固醇常以酯制由于合成类固醇常以酯制剂注入动物剂注入动物,水解后使酯类释放出游离的类固醇水解后使酯类释放出游离的类固醇3、净化、净化l粗提取液的粗提取液的净化方法净化方法包括液包括液-液萃取、固相萃取液萃取、固相萃取法、液相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色法、液相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色谱等l为了达到更好的纯化效果为了达到更好的纯化效果,可将几种方法结合应可将几种方法结合应用液液-液萃取法液萃取法l液液-液萃取大多是液萃取大多是去除去除水溶性提取液中的水溶性提取液中的脂肪脂肪,l例如例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷,可脱去脂可脱去脂类物质l脂肪样中的激素脂肪样中的激素(30种雄激素种雄激素)可用可用正己烷提取正己烷提取,再用甲醇再用甲醇-醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液(pH5.2)提取正己烷中的激素提取正己烷中的激素,同时去除脂类同时去除脂类物质物质,水性提取液再用二氯甲烷抽提水性提取液再用二氯甲烷抽提l当当乙腈乙腈粗提取液调节粗提取液调节pH至至13时时,加入加入正己烷正己烷和和二氯甲烷二氯甲烷进行进行三相液三相液-液萃取液萃取,极性和离子型酸性物质进入水相极性和离子型酸性物质进入水相,脂脂类等低极性物质则进入上层正己烷相中类等低极性物质则进入上层正己烷相中,而中等极性物质而中等极性物质(如待测物：群勃龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮如待测物：群勃龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮)进入中间乙腈相中。

进入中间乙腈相中固相萃取法固相萃取法l柱层析采用柱层析采用氧化铝氧化铝、、硅胶硅胶和和Celite吸附剂吸附剂,可有效分离分可有效分离分析物和内源性杂质析物和内源性杂质,已应用于肉样中七种类固醇的纯化已应用于肉样中七种类固醇的纯化l固相萃取法具有简便、快速、经济等优点固相萃取法具有简便、快速、经济等优点,已广泛应用于已广泛应用于激素类药物的净化激素类药物的净化l正相柱正相柱常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂,反相反相柱柱常用常用C18和和C8吸附剂lC18固相萃取柱和固相萃取柱和Amberlite XAD-2离子交换柱适合纯化离子交换柱适合纯化亲脂性亲脂性或或中性中性的同化激素的同化激素l司坦唑醇在司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的是由于它的结构为吡唑环和雄结构为吡唑环和雄(甾甾)烷环缩合而成烷环缩合而成,两个活泼氢可解离两个活泼氢可解离,具有离子化的性质具有离子化的性质,可与固定相或玻璃的活性点发生吸附可与固定相或玻璃的活性点发生吸附,但其在但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中和苯磺酸型的混合固定相小柱中,净化效果和净化效果和回收率均佳。

回收率均佳lC18和硅胶的和硅胶的混合柱混合柱同样被用来对粗提取液的纯化同样被用来对粗提取液的纯化lC8、硅胶和氨基型的、硅胶和氨基型的混合固定相小柱混合固定相小柱被成功地应用于肉被成功地应用于肉中同化激素和异化激素的分离中同化激素和异化激素的分离,激素按照极性、非极性和激素按照极性、非极性和酚类性质分段流出酚类性质分段流出,然后再分别纯化然后再分别纯化l固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求,因此有人将固相萃取法与色谱法相结合因此有人将固相萃取法与色谱法相结合,对样品提取液作对样品提取液作更高的纯化更高的纯化l另外另外,还有采用还有采用C18柱对样液色谱分离柱对样液色谱分离,用自动馏分收集器用自动馏分收集器收集分析物的馏分收集分析物的馏分,馏分收集后吹干馏分收集后吹干,然后衍生化然后衍生化GC分析柱切换技术柱切换技术l柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备l例如例如,将牛肝提取液注入凝胶柱中将牛肝提取液注入凝胶柱中,含同化激素的含同化激素的两段馏分被切入到硅胶柱两段馏分被切入到硅胶柱(富集柱富集柱)中中,群勃龙和群勃龙和去甲睾酮激素在富集柱中被浓缩纯化去甲睾酮激素在富集柱中被浓缩纯化,洗脱后流洗脱后流入氰基柱中入氰基柱中,再通过柱切换再通过柱切换,流入硅胶分析柱中分流入硅胶分析柱中分离测定。

离测定l醋酸美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇醋酸美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇,固相萃固相萃取法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯取法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯化效果欠佳化效果欠佳,故采用故采用柱切换柱切换l其过程为粗提取液注入其过程为粗提取液注入苯基柱苯基柱中作初级分离中作初级分离,含含分析物的馏分被切换到分析物的馏分被切换到硅胶预富集柱硅胶预富集柱中中,浓缩提浓缩提纯后再通过柱切换洗脱至纯后再通过柱切换洗脱至硅胶分析柱硅胶分析柱中分离测中分离测定定;若收集馏分若收集馏分,可用于可用于GC-MS分析免疫亲和柱色谱法免疫亲和柱色谱法l免疫亲和柱具有专一性高的优点免疫亲和柱具有专一性高的优点,但适合但适合同化激素纯化同化激素纯化的的免疫亲和柱目前还不多免疫亲和柱目前还不多l对于多残留分析对于多残留分析,可将几种免疫亲和固定相配伍使用可将几种免疫亲和固定相配伍使用l免疫亲和柱已应用于生物样品中己烯雄酚、双烯雌酚和免疫亲和柱已应用于生物样品中己烯雄酚、双烯雌酚和己烷雌酚的纯化己烷雌酚的纯化,以及肉和尿中去甲睾酮、睾酮和群勃龙以及肉和尿中去甲睾酮、睾酮和群勃龙的纯化l此外此外,亦有报道采用亦有报道采用免疫亲和色谱法免疫亲和色谱法,对生物样品中对生物样品中的去甲睾酮及其表代谢物进行纯化。

的去甲睾酮及其表代谢物进行纯化超临界流体色谱法超临界流体色谱法l超临界流体萃取可以在低温条件下获得无溶剂超临界流体萃取可以在低温条件下获得无溶剂的提取物的提取物,且快速且快速,但从生物样品中分离激素的研但从生物样品中分离激素的研究目前还很少究目前还很少l有报道采用超临界流体萃取和超临界流体色谱有报道采用超临界流体萃取和超临界流体色谱相结合相结合,用来检测猪肾中己烯雌酚、己二烯雌酚用来检测猪肾中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚残留和己烷雌酚残留l超临界超临界CO2提取时提取时,同化激素被柱子保留同化激素被柱子保留,而非极而非极性的内源性物质不被保留性的内源性物质不被保留,然后换流动相来洗脱然后换流动相来洗脱激素激素,串联质谱检测串联质谱检测l用超临界用超临界CO2提取牛组织中提取牛组织中7种促生长激素种促生长激素,发现极性药发现极性药物物(地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低的回收率偏低,约约44%~58%,非极性药物非极性药物(醋酸美仑孕酮、甲羟孕酮、己烯醋酸美仑孕酮、甲羟孕酮、己烯雌酚雌酚)的回收率相当高的回收率相当高,约约83%~91%l由于共萃取物的干扰由于共萃取物的干扰,群勃龙不能被检测到群勃龙不能被检测到,尤其是脂肪尤其是脂肪和肝脏样品中的共萃取物和肝脏样品中的共萃取物,对群勃龙的色谱峰有严重干扰。

对群勃龙的色谱峰有严重干扰因此因此,超临界流体萃取法并不能取代所有的样品处理方法超临界流体萃取法并不能取代所有的样品处理方法l在超临界流体萃取前后在超临界流体萃取前后,还需要其他净化方法加以处理还需要其他净化方法加以处理三、分析方法三、分析方法 （一）（一）皮质激素分析方法皮质激素分析方法l有关动物性食品中皮质激素类的残留分析有关动物性食品中皮质激素类的残留分析,文献报道很少文献报道很少l皮质激素类的残留分析主要采用皮质激素类的残留分析主要采用色谱法色谱法,包括薄层色谱法、包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法液相色谱法和气相色谱法1、薄层色谱法、薄层色谱法l薄层色谱法具有设备简单、经济等优点薄层色谱法具有设备简单、经济等优点,适合生物样品的适合生物样品的筛选分析筛选分析l早期采用苯肼硫酸溶液作显色剂早期采用苯肼硫酸溶液作显色剂,后来采用其他一些后来采用其他一些显色显色剂剂,如磷酸甲醇溶液、四唑蓝、对甲苯磺酸和如磷酸甲醇溶液、四唑蓝、对甲苯磺酸和2,3,5-三苯三苯基基-2H-四唑氯lVanoosthµyze等建立了一种等建立了一种高效薄层色谱法高效薄层色谱法,能够检测注能够检测注射部位中的射部位中的29种皮质激素。

种皮质激素l样液滴注于样液滴注于Kieselgel 60板上板上,以以氯仿氯仿-甲醇甲醇作展开剂作展开剂,展开展开后组分得到很好地分离后组分得到很好地分离,用用2,4-二羟苯甲醛二羟苯甲醛喷雾显色喷雾显色,色泽色泽差异明显差异明显,366nm处荧光检测分析物处荧光检测分析物2、气相色谱法、气相色谱法lGC法分析动物源性食品中皮质激素法分析动物源性食品中皮质激素,早期采用早期采用TMS衍生衍生化化,OV-17 275cm柱分离柱分离,电子捕获检测器检测电子捕获检测器检测l例如例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松松TMS衍生化衍生化,采用采用N,O-双双(三甲基甲硅烷基三甲基甲硅烷基)乙酰胺、三乙酰胺、三甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生剂进行硅烷化甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生剂进行硅烷化l目前目前,GC-MS得到了广泛应用测定地塞米松时得到了广泛应用测定地塞米松时,用用TMS-enol-TMS衍生化较好衍生化较好例子：例子：lDelahaµt等报道了一种等报道了一种GC-MS法法分析肝脏、牛奶、尿样分析肝脏、牛奶、尿样和粪样中的和粪样中的5种皮质激素种皮质激素(氢化波尼松、甲基强的松龙、氢化波尼松、甲基强的松龙、地塞米松地塞米松,双氟美松和异氟烷双氟美松和异氟烷)。

⑴⑴不同样品的提取不同样品的提取l肝脏样品：肝脏样品：取取5g肝样加肝样加10mL醋酸盐缓冲液均质醋酸盐缓冲液均质,加入加入Helix pomatia混合酶混合酶,于于60℃ 孵育孵育2h,水解结束后水解结束后,用用20mL乙腈提取乙腈提取,离心离心,取出上清液并加入取出上清液并加入8mL正己烷和正己烷和2mL二氯甲烷混合二氯甲烷混合,离心离心,取出中间乙腈相层并蒸发至干取出中间乙腈相层并蒸发至干,残余物用残余物用1mL乙醇溶解乙醇溶解,过过C18固相萃取柱固相萃取柱⑴⑴不同样品的不同样品的提取提取l牛奶样品：牛奶样品：取取10mL牛奶牛奶,于于4℃ 离心离心,除去浮在上面的脂除去浮在上面的脂肪并将剩下的脱脂奶用等量的水稀释肪并将剩下的脱脂奶用等量的水稀释,过过C18固相萃取柱固相萃取柱l尿样：尿样：取取5mL尿样尿样,加入加入2mL pH4.8醋酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液和Helix pomatia混合酶混合酶,于于37℃孵育过夜孵育过夜,水解结束后水解结束后,加入加入5mL磷酸缓冲盐磷酸缓冲盐,过过C18固相萃取柱固相萃取柱l粪样：粪样：取取5g粪样粪样,加入加入10mL醋酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液和35mL乙醚乙醚,振摇振摇,离心后取出乙醚相并蒸发至干离心后取出乙醚相并蒸发至干,残余物用残余物用3mL乙醇乙醇溶解溶解,加入加入12mL水和水和5mL正己烷正己烷,振摇振摇,静止分层后取出水静止分层后取出水相相,过过C18固相萃取柱。

固相萃取柱⑵⑵不同提取样品的不同提取样品的净化净化l牛奶、尿和粪便样液过牛奶、尿和粪便样液过C18固相萃取柱固相萃取柱后后,依次用依次用5mL水、水、5mL丙酮丙酮-水水(20+80)、、5mL甲醇甲醇-水水(20+80)、、5mL二氯甲二氯甲烷烷-正己烷正己烷(20+80)和和5mL乙酸乙酯乙酸乙酯-正己烷正己烷(10+90)淋洗淋洗,用用3mL乙酸乙酯洗脱皮质激素乙酸乙酯洗脱皮质激素,洗脱液蒸发至干后洗脱液蒸发至干后,用用0.5mL乙醇和乙醇和5ml磷酸缓冲盐溶液溶解残余物磷酸缓冲盐溶液溶解残余物,过免疫亲过免疫亲和柱净化和柱净化l肝脏样液过肝脏样液过C18固相萃取柱后固相萃取柱后,依次用依次用5mL水、水、5mL丙酮丙酮-水水(20+80)、、5mL甲醇甲醇-水水(20 +80)和和5mL正已烷淋洗正已烷淋洗,用用1mL乙酸乙酯洗脱经过乙酸乙酯洗脱经过固相萃取柱固相萃取柱净化后净化后,将洗脱液的将洗脱液的pH值调至值调至7~7.5,再过再过免疫亲和柱免疫亲和柱(含地塞米松和氢化波尼含地塞米松和氢化波尼松抗体的凝胶松抗体的凝胶)纯化纯化,用水淋洗柱子用水淋洗柱子,3mL甲醇甲醇-水水(80+20)洗脱。

取部分洗脱液洗脱取部分洗脱液,加入加入氯铬酸吡啶氧化氯铬酸吡啶氧化,氧化的皮质氧化的皮质激素衍生物进行激素衍生物进行GC-MS分析分析lCourtheyn等对氯铬酸吡啶氧化法作了改进等对氯铬酸吡啶氧化法作了改进,简化了样品简化了样品前处理步骤前处理步骤,采用采用负离子化学电离负离子化学电离GC-MS法法测定尿液和测定尿液和粪便中地塞米松含量粪便中地塞米松含量,以二氟美松作内标以二氟美松作内标,测定结果与酶测定结果与酶联免疫法一致联免疫法一致,该方法检测限该方法检测限<0.1µg/L3、液相色谱法、液相色谱法l反相液相色谱（反相液相色谱（RP-HPLC ））和和正相液相色谱（正相液相色谱（ NP-HPLC ））均可用于皮质激素的分析均可用于皮质激素的分析l由于皮质激素有较由于皮质激素有较强强的的紫外吸收紫外吸收,因此紫外检测法常被广因此紫外检测法常被广泛采用泛采用,检测波长一般设在检测波长一般设在254nml但对于动物源食品中残留的某些皮质激素及其代谢物但对于动物源食品中残留的某些皮质激素及其代谢物,则则必须制备成必须制备成衍生物衍生物后后,进行进行荧光检测荧光检测lHPLC-MS技术在皮质激素分析中也有应用技术在皮质激素分析中也有应用,例如例如,LC-APCI-MS对牛组织中地塞米松的鉴别测定。

对牛组织中地塞米松的鉴别测定lGoto等报道了等报道了NP-HPLC法同时分离测定血清中的地塞法同时分离测定血清中的地塞米松和氢化可的松这种方法包括用米松和氢化可的松这种方法包括用9-蒽腈进行蒽腈进行柱前荧柱前荧光衍生化光衍生化,衍生物经衍生物经固相萃取柱固相萃取柱净化净化,以除去过量的衍生以除去过量的衍生剂及内源性的类固醇杂质剂及内源性的类固醇杂质,色谱分离后用色谱分离后用荧光检测荧光检测lPrasad等采用等采用NP-HPLC法同时测定血浆中氢化可的松、法同时测定血浆中氢化可的松、可的松、地塞米松、强的松、氢化波尼松和甲基强的松可的松、地塞米松、强的松、氢化波尼松和甲基强的松龙残留龙残留,最低检测限为最低检测限为10µg/LlSantos-Montes采用采用RP-HPLC测定尿中的皮质醇和可的测定尿中的皮质醇和可的松lSchild采用采用RP-HPLC测定血浆中的地塞米松测定血浆中的地塞米松lFluri等研究了电喷雾电离等研究了电喷雾电离LC-MS测定人尿中测定人尿中9种糖皮质种糖皮质激素的方法激素的方法l崔晓亮等采用超高效液相色谱崔晓亮等采用超高效液相色谱-串联电喷雾四极杆质谱串联电喷雾四极杆质谱法同时测走牛奶中法同时测走牛奶中12种糖皮质激素的残留。

种糖皮质激素的残留lVan de Hauwe等报道了电喷雾电离等报道了电喷雾电离LC-MS/MS法测定牛法测定牛组织中地塞米松和二氟美松残留量组织中地塞米松和二氟美松残留量lSangiorgi等采用大气压化学电离等采用大气压化学电离LC-MS/MS测定牛尿中测定牛尿中7种糖皮质激素种糖皮质激素lVan de Hauwe等报道了采用电喷雾电离等报道了采用电喷雾电离LC-MS/MS分析分析牛肝中牛肝中11种糖皮质激素种糖皮质激素（二）（二）同化激素分析方法同化激素分析方法l生物样品中同化激素类的分析主要采用生物样品中同化激素类的分析主要采用色谱法色谱法,包括包括薄层薄层色谱法、色谱法、气相气相色谱法和色谱法和液相液相色谱法1、薄层色谱法、薄层色谱法l薄层色谱法具有快速、经济等优点薄层色谱法具有快速、经济等优点,适合残留分析的初筛适合残留分析的初筛l例如例如,用于雌激素的多残留筛选用于雌激素的多残留筛选l为了提高薄层色谱分析的灵敏度和选择性为了提高薄层色谱分析的灵敏度和选择性,在在显色剂显色剂研究研究上做了大量的工作上做了大量的工作,一些与雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉一些与雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉烯醇发生显色反应的米赤霉醇和玉米赤霉烯醇发生显色反应的染料染料被相继报被相继报道。

道l重氮基染料重氮基染料与雌激素反应与雌激素反应,形成重氮基衍生物、酚基和二形成重氮基衍生物、酚基和二羟基苯甲酸内酯类的雌激素衍生物羟基苯甲酸内酯类的雌激素衍生物,它们的色泽强度各不它们的色泽强度各不相同l此外此外,科林斯红科林斯红和和快蓝快蓝BB与激素反应成盐后与激素反应成盐后,具有很强的具有很强的色泽2、气相色谱法、气相色谱法l在在20世纪世纪70年代年代GC-MS已被用于同化激素的分析已被用于同化激素的分析l20世纪世纪80年代出现的毛细管年代出现的毛细管GC使使GC-MS结构简化、仪结构简化、仪器成本下降器成本下降毛细管毛细管GC和和SIM检测检测方式使方式使GC-MS发展发展成为一种成熟的、集高效分离、高灵敏度检测和结构鉴成为一种成熟的、集高效分离、高灵敏度检测和结构鉴定为一体的分析技术定为一体的分析技术l目前目前,GC-MS已成为同化激素残留分析中普遍采用的方已成为同化激素残留分析中普遍采用的方法SIMSIM检测检测：： 选择离子监测技术选择离子监测技术l同化激素及其代谢产物的结构中含有多个羟基或酮基等同化激素及其代谢产物的结构中含有多个羟基或酮基等极性基团极性基团,为为高极性高极性、、难挥发难挥发、、热稳定差热稳定差的化合物的化合物,GC法法难以直接分析难以直接分析,因此需因此需衍生化衍生化使形成易挥发、热稳定性好使形成易挥发、热稳定性好的衍生物的衍生物,以提高其色谱性能。

以提高其色谱性能l由于它们的结构中含羟基和酮基由于它们的结构中含羟基和酮基,常用的常用的衍生方法衍生方法包括包括硅硅烷化烷化、、酰化酰化和和肟化肟化例子：例子：l1992年年,Daeseleire等报道了等报道了GC-MS法测定牛肉和牛尿中法测定牛肉和牛尿中多种同化激素多种同化激素(去甲睾酮、睾酮、雌二醇、炔雌醇、孕去甲睾酮、睾酮、雌二醇、炔雌醇、孕酮、群勃龙、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氢睾酮、美雄酮、群勃龙、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氢睾酮、美雄酮、甲睾酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟酮、甲睾酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮、氯睾酮、醋酸氯睾酮孕酮、氯睾酮、醋酸氯睾酮)的残留l样品用葡萄糖苷酸样品用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶水解芳基硫酸酯混合酶水解,经经液液-液萃取液萃取和和固相萃取柱净化固相萃取柱净化,再通过再通过HPLC纯化纯化,分别收集含分析物分别收集含分析物的五段馏分的五段馏分,衍生后衍生后GC-MS检测检测l1997年年,Hartmann等报道了等报道了GC-MS法测定牛肉组织中类法测定牛肉组织中类固醇激素固醇激素,包括雄烯二酮、雄酮、睾酮包括雄烯二酮、雄酮、睾酮 、孕酮、雌酮、、孕酮、雌酮、雌二醇、脱氢表雄酮、二氢睾酮、表睾酮、羟孕酮、孕雌二醇、脱氢表雄酮、二氢睾酮、表睾酮、羟孕酮、孕烯醇酮、雌三醇、甲基睾酮和甲羟孕酮。

烯醇酮、雌三醇、甲基睾酮和甲羟孕酮l2003年年,Dickson等采用等采用GC-MS法筛选和确证牛尿中己烯法筛选和确证牛尿中己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和玉米赤霉醇的残留雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和玉米赤霉醇的残留l2005年年,Seo等报道了等报道了GC-MS法同时测定肌肉中多种促生法同时测定肌肉中多种促生长激素长激素(雌二醇及其代谢物、睾酮、孕酮、玉米赤霉醇、雌二醇及其代谢物、睾酮、孕酮、玉米赤霉醇、已烯雌酚已烯雌酚)3、液相色谱法、液相色谱法lHPLC比比GC更常用于激素的分析更常用于激素的分析雌性激素的分析：雌性激素的分析：l分析极性较大的雌激素结合物常采用分析极性较大的雌激素结合物常采用阴离子交换色谱法阴离子交换色谱法或或反相离子对色谱法反相离子对色谱法,尤其是后者分离效果更好尤其是后者分离效果更好l环糊精色谱环糊精色谱也被用于雌激素的分析也被用于雌激素的分析,该法能有效地分离结该法能有效地分离结构异构的雌激素结合物构异构的雌激素结合物l雌二醇和雌三醇在雌二醇和雌三醇在200nm处有一中等强度的较尖的紫外处有一中等强度的较尖的紫外吸收峰吸收峰,在在280nm处有一较宽的弱吸收峰。

处有一较宽的弱吸收峰l此外此外,雌二醇和雌三醇还具有雌二醇和雌三醇还具有天然荧光天然荧光浓度较高的生物浓度较高的生物样品样品,采用采用紫外检测紫外检测能获得足够的灵敏度能获得足够的灵敏度,也可利用天然也可利用天然荧光的特性而采用荧光的特性而采用荧光检测荧光检测,后者尤其适合测定较低的残后者尤其适合测定较低的残留量留量,l但因雌酮无法利用荧光检测但因雌酮无法利用荧光检测,实际工作中常将紫外检测器实际工作中常将紫外检测器与荧光检测器结合使用以提高检测能力与荧光检测器结合使用以提高检测能力l可食动物组织中雌激素的浓度较低可食动物组织中雌激素的浓度较低,采用采用电化学检测电化学检测可获可获得较高的灵敏度得较高的灵敏度l将激素进行将激素进行化学衍生化化学衍生化后可采用后可采用荧光检测荧光检测或或化学发光检化学发光检测测l孕酮和睾酮在孕酮和睾酮在240nm处有较强紫外吸收处有较强紫外吸收,紫外检测紫外检测RP-HPLC法是分析生物样品的主要方法法是分析生物样品的主要方法l一般紫外检测可获得足够的灵敏度一般紫外检测可获得足够的灵敏度,但荧光检测更适合于但荧光检测更适合于组织样品的测定组织样品的测定。

l动物组织动物组织中的玉米赤霉醇和己烯雌酚的残留量通常为中的玉米赤霉醇和己烯雌酚的残留量通常为µg/kg级级,为获得足够的检测灵敏度为获得足够的检测灵敏度,可采用可采用电化学检测电化学检测或或质谱检测质谱检测雄性激素的雄性激素的HPLC分析：分析：lRP-HPLC和和NP-HPLC均被用于雄激素的分析均被用于雄激素的分析l体液中睾酮含量较高时体液中睾酮含量较高时,可采用可采用紫外检测紫外检测;否则否则,可将睾酮可将睾酮与衍生化试剂反应制备成与衍生化试剂反应制备成荧光衍生物荧光衍生物后再用紫外检测后再用紫外检测,或或采用高灵敏度的采用高灵敏度的荧光检测器荧光检测器进行检测进行检测l甲睾酮的分析常用甲睾酮的分析常用RP-HPLC法法,一般情况下一般情况下,采用紫外检采用紫外检测能获得足够的灵敏度测能获得足够的灵敏度,但肌肉组织中甲睾酮代谢物残留但肌肉组织中甲睾酮代谢物残留量通常为量通常为µg/kg级级,且甲睾酮代谢物的分子结构中无生色且甲睾酮代谢物的分子结构中无生色团团,无法利用紫外检测无法利用紫外检测,有报道采用有报道采用柱后固定化酶衍生化柱后固定化酶衍生化结合荧光检测的方法结合荧光检测的方法,其定量限为其定量限为1µg/kg。

此此,HPLC-MS法在睾酮分析中也有应用法在睾酮分析中也有应用lLagana等报道等报道LC法法检测鸡肉、牛肉和牛肝中检测鸡肉、牛肉和牛肝中9种同化激种同化激素素(群勃龙、睾酮、孕酮、雌二醇、己烯雌酚、左环十群勃龙、睾酮、孕酮、雌二醇、己烯雌酚、左环十四酮酚、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇四酮酚、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇)残留lAndresen等报道了等报道了LC法法测定脂肪中醋酸美仑孕酮、醋测定脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮的残留量酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮的残留量l万美梅等采用万美梅等采用LC-电化学检测法电化学检测法测定动物组织中己烯雌测定动物组织中己烯雌酚残留量酚残留量lDavoli等报道了等报道了萃取液相色谱萃取液相色谱/快速原子轰击质谱法快速原子轰击质谱法测定鼠和牛尿中己烯雌酚的残留测定鼠和牛尿中己烯雌酚的残留lFang等报道了等报道了LC-MS/MS法法测定鸡和兔肝中玉米赤霉醇测定鸡和兔肝中玉米赤霉醇残留量l秦燕等建立了不同动物肌肉中类固醇同化激素秦燕等建立了不同动物肌肉中类固醇同化激素(表睾酮、表睾酮、丙酸睾酮、丙酸睾酮、19-去甲基睾酮、甲基睾酮、孕酮、甲羟孕去甲基睾酮、甲基睾酮、孕酮、甲羟孕酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮)多残留的多残留的LC-MS/MS分析方法分析方法。