一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌.pdf

应用与环境生物学报 2003, 9( 3) : 322~ 325 Chin J Appl Environ Biol = ISSN 1006- 687X 2003 - 06 -25一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌齐 云 陈 飞 袁月祥 刘晓风 廖银章*( 中国科学院成都生物研究所 成都 610041)摘 要 对一株分离于堆肥的分解纤维素的放线菌的形态学和生理生化特征进行了研究. 结果表明: 基丝由分枝发达的不断裂的菌丝组成, 气丝发达; 孢子单个长在气丝上, 孢子表面光滑, 细胞壁含 meso -DAP; 该菌能分解纤维素, 液化 明胶、 水解酪素和淀粉, 在 35~ 60 e 生长, pH 范围为 6. 0~ 12. 0. 按5伯杰氏系统细菌学鉴定手册6进行了鉴定, 初步将此菌归为高温单孢菌属( Thermomonospora sp. )的一个新种. 研究了产羧甲基纤维素酶( CMCase) 和滤纸酶(FPA) 的条 件. CMCase 最适产酶时间为 5 d, FPA 为 8 d, 最适产酶温度为 50 e , 产酶最适起始 pH 为 9. 5~ 10. 5. 最适氮源为黄豆粉, 最佳碳源为棉花纤维. 图 6 表 2 参 10 关键词 放线菌; 高温单孢菌; 纤维素酶CLC Q939. 130. 5A CELLULOSE DEGRADING THERMOPHILIC ALKALITOLERANT ACTINOMYCETEQI Yun, CHEN Fei, YUAN Yuexiang, LIU Xiaofeng Thermomonospora sp. ; cellulase CLC Q939. 130. 5从资源利用和环境保护出发, 生物处理农业废弃物及城市有机垃圾是最有潜力的方法. 由于大部分有机固体废弃物中主 要含纤维, 因而纤维素的降解速度问题就成为处理含纤维素废弃物的关键因素, 因此研究分解纤维素的微生物对于解决环境污染和能源问题有重要的意义. 目前, 国内外对降解纤维素的 真菌、 细菌及其产酶条件等研究较多, 而对分解纤维素的放线菌研究尚少[ 1~ 6]. 我们从堆肥中分离了一株分解纤维素的放线菌, 在垃圾发酵中应用得到了较好的效果. 现将对该菌株的 初步研究结果报告如下.1 材料与方法1. 1 菌 种 堆肥中用划线分离法 55 e 分离得到, 编号为 Q -0.1. 2 培养基1. 2. 1 高温放线菌培养基( Q/g L- 1) 蛋白胨 10. 0, 酵母提收稿日期: 2003 - 01 -10 接受日期: 2003 -03 -11 * * 通讯作者 Corresponding author ( E -mail: LiaoYZ@cib.ac. cn)取物 2. 0, 水解酪素 2. 0, NaCl 6. 0 葡萄糖10. 0, 琼脂 18; pH 7.2.1. 2. 2 发酵培养基的组成( Q/g L- 1) 蛋白胨 3. 0, 酵母提 取物 0. 5, ( NH4)2SO42. 0, KH2PO44. 0, CaCl2. 2H2O 0. 3, MgSO4. 7H2O 0. 3, CMC -Na 5. 0; pHU 7. 2 .1. 3 形态观察及生理生化特性 生理生化特征参照5伯杰系统细菌学鉴定手册6[ 7]和微生物分类学[ 8]. 形态观察用盖片法、插片法, 在光学显微镜、 扫描 电子显微镜下观察. 1. 4 培养条件 250 mL 三角瓶中装入 50 mL 发酵培养基, 按 5% 接种量接种, H= 50 e , n= 150 r min- 1摇床培养. 1. 5 粗酶液的制备及酶活的测定 1. 5. 1 粗酶液的制备 将发酵液直接于3 000 r min- 1离心 15 min, 取上清液.1. 5. 2 酶活的测定 参照文献[9] 的 CMCase 及 FPA 测定 方法. 一个酶活单位( International Unit, IU) 定义为 1 min 内转化底物产生 1 Lmol 还原糖( 以葡萄糖计)所需的酶量.2 结果2. 1 形态特征 该菌菌落较小, 白色. 基内菌丝宽 0. 3~ 1. 0 Lm, 微黄色, 发达, 较细, 色浅, 多分枝, 交织成网, 不形成横隔, 不断裂. 气丝白色, 粉末状, 气生菌丝发达, 宽 1. 4~ 2. 1 Lm, 孢子单个着生 在气丝的小孢子梗上, 基丝上不长孢子, 孢子直径 0. 4~ 0. 7Lm, 表面光滑, 圆形, 孢子非内生, 不具有内生孢子的结构.图 1 扫描电子显微镜( @ 15 000) Fig 1 SEM graph of the spore ( @ 15 000)2. 2 培养特征 在不同培养基[ 10]中的生长情况见表 1. 在培养过程中均无可溶性色素产生. 表 1 放线菌 Q -0 在不同培养基中的培养特征 Tab 1 Culture characteristics in different culture media培养基[10] Media生长* Growth*基内菌丝 Substrate mycelium气生菌丝 Aerial mycelium无机盐淀粉琼脂 Inorganic salts starch agars---葡萄糖天门冬素琼脂 Glucose asparagine agars?微黄 Light yellow亮白 Bright white马铃薯块 Potato medium?微黄 Light yellow灰白 Offwhite蔗糖察氏琼脂 Czapek sucrose agars?亮白 Bright white灰白 Offwhite高氏一号琼脂 Gauze No. 1 agars?灰白 Offwhite亮白 Bright white酪氨酸琼脂 Tyrosine agars+乳白 Lacteus亮白 Bright white牛肉膏蛋白胨琼脂 Beef extract peptone agars+黄色 Yellow亮白 Bright white酵母膏琼脂 Yeast extract agars+灰白 Offwhite亮白 Bright white*- : 不生长 No growth; ? : 生长但较差 Poor growth;+ : 生长 Good growth2. 3 纤维素降解 在固体纤维素平板上, 培养 4 d 即产生明显的分解纤维素透明圈, 在液体纤维素试管中, 培养 7 d 滤纸条开始变黄, 15 d 开始崩溃.2. 4 菌株碳源利用及其它生理生化特征 菌株可较好的利用葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 肌醇、 菊糖、 海藻 糖、 果糖; 不利用木糖、 甘露醇、 鼠李糖、 棉糖或半乳糖; 能分解纤维素、 液化明胶、 不凝固或胨化牛奶、 能水解酪素及淀粉、 不 能使硝酸盐还原为亚硝酸盐, 不产生硫化氢. 菌株可在 35~ 60e 之间生长, 最适温度为 50~ 55 e . pH 范围是 6. 0~ 12. 0, 最 适为 7. 0~ 8. 0 之间. 孢子对热敏感, 孢子悬液中的孢子在 90e 加热 30 min 死亡. 细胞壁Ó型, 细胞壁含有内消旋二氨基 庚二酸( meso -DAP), 全细胞水解液无特征性糖. 菌株对大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、 酵母菌、 青霉菌均无抗 性.2. 5 发酵条件的选择 2. 5. 1 培养时间对产酶的影响 在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL 发酵培养基, 按5% 接种量接种, 于 50 e 恒温摇床培养. 定时取样测FPA 和CMCase,结果见图 2. 该菌在培养 5 d 时CMCase 最 高, 以后有所下降并保持稳定. FPA 在培养8 d达到高峰.图 2 不同培养时间( t/d) 对菌株产酶活力( K /U mL- 1)的影响 Fig 2 Effect of the time( t/ d) on enzyme activity( K /U mL- 1)2. 5. 2 培养温度对产酶的影响 在 250 mL 三角瓶中装入50 mL 发酵培养基, 在 35~ 60 e 之间的 6 个不同温度下培养, 5 d时测 CMC 酶活, 8 d 时测 FPA, 结果见图 3. 该菌产酶的最适温度是 50~ 55 e .图 3 不同 H/ e 对菌株产酶活力( K ) 的影响Fig 3 Effect of the temperature on enzyme activity( K ) 2. 5. 3 培养基起始 pH 对菌株产酶的影响 在 250 mL 三323 3 期齐 云等: 一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌 表 2 其它高温单孢菌与 Q -0的比较* Tab 2 The difference between T hermomonspora strains and Q -0*T . curvataT . f uscaT . albaT . chromogenaQ - 0基内菌丝上产生孢子 Spores on substrate mycelium-dd-- 气生菌丝上孢子的排列 Arrangement of aerial mycelium spore成簇 Clusters-+d+-孢子表面特征 Spore surface ornamentation刺状 Spiny光滑 Smooth 光滑 Smooth刺状 Spiny光滑 Smooth孢子梗分枝 Branched sporophores+-d--短孢子梗 Short sporophores----+ 液体培养形成菌膜 Pellicle formed in liquid culture+++-+生长 Growth atH30 ed-d--H35 e+d+-+H53 ed+d++H60 e-d--+pH 6. 0-ddd+pH 10. 0+++d+pH 11. 0+++-+pH 12. 0-d--+ 生长 Growth withQ( NaCl) = 30g L- 1-ddd+Q( NaCl) = 50g L- 1----+硝酸盐还原反应 Nitrate reduction+-d+- 分解 Degradation of纤维素 Cellulose+++-+酪素 Tyrosine---++淀粉 Starch+++-+ 生长 Growth on* *D-木糖 D -Xylosed-dd-蔗糖 Sucrose+++-+甘露醇 Mannitol---d-L -鼠李糖 L-Rhamnose---d-D -半乳糖 D - Galactose-+d+-*+ : 90% 及大于 90% 的菌株为阳性反应; - : 10% 或少于10% 的菌株为阴性; d: 11%~ 89% 的菌株为阳性反应+ : 90% or more of strains are positive; - : 10% or less of strains are positive; d: 11% ~ 89% of strains are positive* *碳源含量为 10 g L- 1Utilizing carbon source of 10 g L- 1角瓶中装入 50 mL 发酵培养基, 调节发酵培养基起始pH, 从 4. 5~ 14之间, 于 50 e 培养 5 d和 8 d, 分别测 CMC 酶活和 FPA, 结 果如图 4 所示, 菌株可在比较宽的 pH 范围内产生纤维素酶, pH在 9. 5~ 10. 5 在之间时产酶较高.图 4 不同起始 pH 对菌株产酶活力( K )影响 Fig 4 Effect of the initial pH of medium on enzyme activity( K ) 2. 5. 4 氮源对纤维素酶形成的影响 除去氮源后的发酵培养基作为基础培养基, 加入不同氮源, 黄豆粉、 酵母膏、 蛋白胨、 牛肉膏的含量为 5 g L- 1, 尿素为 3 g L- 1, 硝。