乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证.doc

学 号：毕业论文GRADUATETHESIS论文题目：乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证学 院：专 业：班 级：姓 名：指导教师：2021年10月31 日目 录毕业论文 学 号：1乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证 3中 文 摘 要 3前 言 51. 材料与方法 51.1 试剂盒51.2 仪器51.3 方法52. 结果 72.1 标准曲线与线性围 72.2 准确度〔回收率〕的验证82.3精细度的验证92.4 检测限〔LOD〕计算 123. 讨论 133.1 乙肝外表抗原定量分析的意义 133.2 常用定量分析方法133.3 方法概述143.4 方法学验证容144. 结果分析及应用评价15参考文献16综 述 17致 18. z-乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘 要目的：随着免疫学技术的不断开展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能，本实验就是对酶联生物生产的乙肝外表抗原的ELISA法定量分析试剂盒进展方法学验证，以判断该试剂盒是否能用于临床低浓度样本的定量分析。

方法：HBsAg的ELISA法定量分析，用浓度为8ng/ml标准品溶液做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精细度和检测限等方法学验证结果：标准曲线R2=0.9979，显示具有良好的相关性；检测限为LOD为0.167ng/ml；准确度99.03%，准确度好；板精细度和板见精细度方面都表现在低浓度样品〔<1.5ng/ml〕的检测低于高浓度样品，重复性差故不适合低浓度样品的检测结论：由于该试剂盒在低浓度样本测量上的精细度差，故该公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不可以用于临床生物低浓度样品的分析关键词HBsAg ELISA 定量分析 方法学验证. z-The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: With the continuous development of immunology and technology, increasing antigen antibody detection sensitivity, makes the detection of low hepatitis b virus，to verify the quantitative methodology of Shanghai enzyme linked Biological Technology to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted si* concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: R2 = 0.9979, standard curve showed good correlation; Detection limit for LOD is 0.167 ng/ml; 99.03% accuracy, good accuracy; Precision and precision of the plate in the plate has performance in low concentration sample (< 1.5 ng/ml) detection is lower than the high concentration samples, poor repeatability. So is not suitable for detection of low concentration samples. Conclusion: Because the kit on the low concentration sample measurement precision is poor，so the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key words:HBsAg; Quantitative analysis; Verification; Methodology.. z-乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证前 言根据流行病学调查,我国人群乙型肝炎病毒感染率为10%左右,乙型肝炎病毒(HBV)感染是最常见的传染病之一。

实验室诊断乙型肝炎对其治疗和预防有重要的参考意义而HBsAg是乙肝病毒感染最早的血清标志物,因此乙肝外表抗原检测是一个重要的乙型肝炎病毒感染的诊断的依据随着免疫学技术的不断开展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能,对于临床诊断和流行病学具有重要意义[1]ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好和定性测定的优点,可以在酶免疫分析仪进展批量检测目前临床上多倾向于做定量分析，假设想得到准确的检验结果，必须要经过实验室的验证，本实验对酶联生物生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进展准确度，精细度和检测限等方法学验证，现将实验结果报告如下：1. 材料与方法1.1 试剂盒乙肝外表抗原ELISA法定量分析试剂盒，酶联生物出品1.2 仪器 酶标仪：EL*800光吸收酶标仪；洗板机：DN*-9620A电脑洗板机；超纯水系统：Millipore Eli* ；电热恒温培养箱(DNP-9052)精宏实验设备；振荡器〔管械，KJ-201A〕；移液器；Tip头；EP管1.3 方法1.3.1．溶液配置 磷酸缓冲液的配备:称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

在15lbf/in2(1034×105Pa)标准品的配备：原始标准品浓度为8 ng/ml取6支2 mlEP管，分别标记为A1-A650ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul留作备用，稀释方案详见表一编号终浓度〔 ng/ml〕预加磷酸缓冲液标记取〔ul〕剩余〔ul〕A180标准品12060A2460A16060A3260A26060A4160A36060A50.560A46060A60.2560A56060表一 标准品的稀释方案质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul留作备用，取3支2mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，质控品稀释方案见表二编号终浓度〔 ng/ml〕预加磷酸缓冲液标记取〔ul〕剩余〔ul〕C16150标准品450300C23300C1300300C31.5300C2300300表二 质控品的稀释方案1.3.2．铺板方案 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中依次参加系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul空白对照参加磷酸缓冲液缓冲液铺板方案见表三序号标准品质控1质控2质控3空白组1A1C1C2C3磷酸缓冲液2A2C1C2C3磷酸缓冲液3A3C1C2C3磷酸缓冲液4A4C1C2C3磷酸缓冲液5A5C1C2C3磷酸缓冲液6A6表三 铺板方案1.3.3．加样步骤 参加酶标抗体，50 ul/well，震荡。

37℃电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次， 参加A、B液, 50 ul/ well，37℃电热恒温培养箱温育15 min参加终止液，50 ul/ well酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上翻开Microplate Manager 5.2软件，选择450nm波长〔参照波长630nm〕，设置layout和报告模式，测定各孔吸收值2. 结果2.1 标准曲线与线性围序号123456HBsAg(ng/ml)84210.50.25吸光度值1.670.990.630.400.310.26表四 标准品理论浓度对应的实测OD值以标准品实际浓度为横坐标，所测吸光度值值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.998，显示具有良好的相关性表五 标准曲线2.2 准确度〔回收率〕的验证质控品理论稀释浓度对应实测浓度值见表六HBsAg(ng/ml)1234566.514.945.676.086.1233.573.073.293.082.951.51.271.361.541.211.59表六 实测浓度值质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，见表七HBsAg(ng/ml)测定值〔ng/ml〕回收率〔%〕平均回收率RR〔%〕3个浓度的平均回收率66.51108.597.7299.03%4.9482.35.6794.56.08101.36.12102.033.57119.0106.403.07102.33.29109.73.08102.72.9598.31.51.2784.792.961.3690.71.54102.71.2180.71.59106.0表七 回收率结果显示HBsAg 6ng/m的平均回收率为97.72%，3ng/ml的平均回收率为106.40%和1.5ng/ml的平均回收率为92.96%，满足限度要求在85%-115%的围，3个浓度梯度的平均回收率为99.0。