可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备.pdf

辽宁师范大学 硕士学位论文 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 姓名：张伟 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：张德民 20070520 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 捅要 本文分别采用密度梯度离心、荧光显微镜观察、瑞氏染色和透射 电镜观察等四种方法对可口革囊星虫的血细胞进行分类，将其分为两 类：透明细胞和颗粒细胞，其中颗粒细胞又分为两个亚型：大颗粒细 胞和小颗粒细胞 经密度梯度离心，血细胞在淋巴细胞分离液中被分为两层，透明 细胞主要位于上层，颗粒细胞则大部分位于下层 在荧光显微镜下可观察到血细胞的自发荧光，在不同波长下透明 细胞与颗粒细胞产生的自发荧光不同 利用瑞氏染色法光镜下观察，透明细胞大多数为圆形或椭圆形， 细胞质透明或淡紫色，细胞表面光滑无胞突，胞质稀少，细胞质内无 明显颗粒，核质比小细胞核为粉色，核中含有深色的致密物质小 颗粒细胞比透明细胞小，细胞质呈黄色或棕黄色，并且其中含有很多 黑色颗粒，细胞核呈粉色圆形，核质比大大颗粒细胞数目最少，胞 质中充满了大的紫黑色的致密颗粒，细胞核粉紫色 透射电镜下观察，透明细胞几乎不含细胞器，核内常染色质丰富。

小颗粒细胞的细胞质中有粗面内质网、高尔基体、线粒体等许多的细 胞器，还含有电子致密颗粒，有伪足大颗粒细胞中充满了电子致密 颗粒 以可口革囊星虫的血细胞作为抗原免疫B a l b ／C 小鼠，取其脾脏， 聚乙二醇为融合剂，将免疫小鼠的脾细胞和S p 2 ／O 小鼠骨髓瘤细胞融 合，用G i b c o 公司的R P M I —1 6 4 0 培养基培养杂交瘤细胞应用酶联免疫 吸附实验( E L I S A ) 检测杂交瘤上清液，检测得到大量阳性杂交瘤细胞， 最终得到8 株具有较高分泌能力的杂交瘤细胞冻存备用 有限稀释法克隆了8 株阳性杂交瘤细胞，通过密度梯度离心分离血 细胞与E L I S A 检测相结合，发现：单抗E B 3 与颗粒细胞发生阳性反应， 单抗D D l 、E D l 与透明细胞发生阳性反应；应用免疫磁珠与可口革囊 星虫的体腔细胞的反应，发现单抗D D l 与透明细胞细胞膜发生阳性反 应；单抗E B 3 与颗粒细胞细胞膜发生阳性反应总而言之，单抗E B 3 似乎是非常有希望用于鉴别和区分颗粒细胞，并且这三株单克隆抗体 将被用于关于细胞的防御机制的进一步研究中 关键词：可口革囊星虫、血细胞、形态结构、分类、单克隆抗体 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 A b s t r a c t F o u rm e t h o d sw e r eu s e dt oc l a s s i f yt h eh e m o c y t eo fP h a s c o l o s o m a e s c u l e n t a ，w h i c ha r ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，s t a i n e db yt h e W r i g h t ’s a n dO b s e r v e d b y f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e a n de l e c t r o n m i c r o s c o p e ． T h e t w ot y p eh e m o c y t e sc a nb es e p a r a t e db yd e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ，w i t ht h eh y a l i n o c y t e sa n dg r a n u l o c y t c sm a i n l ya b o v ea n d b e l o wt h ei n t e r f a c e ．U n d e rf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ，h a e m o c y t e sw e r e c l a s s i f i e di n t o h y a l i n o c y t e a n d g r a n u l o c y t e ，a c c o r d i n g t h ea u t o — f l u o r e s c e n c eo fh e m o c y t e s ． S m e a r sw e r es t a i n e db yt h eW r i g h t ’sa n dt h e no b s e r v e du n d e rt h e l i g h tm i c r o s c o p e ．H y a l i n o c y t e sw e r es t a i n e dl i g h tp u r p l e ．T h e yd on o t c o n t a i nc h a r a c t e r i s t i cg r a n u l e s ．A m o n gg r a n u l o c y t e st w os u b t y p e sw e r e f u r t h e r d i s t i n g u i s h e d ：t h es m a i lg r a n u l a rc e l l s w a ss m a l l e rt h a n h y a l i n o c y t c s a n dc o n t a i nn u m e r o u sg r a n u l e si n c y t o p l a s m ，T h eb i g g r a n u l a rc e l l sa r ef i l l e dw i t hv e r yo b v i o u sl a r g eg r a n u l e s ．T h eg r a n u l e s w e r es t a i n e dp u r p l e ． O b s e r v e da tt h eu l t t a s t r u c t u r a l l e v e l b y e l e c t r o n m i c r o s c o p e ， h y a l i n o c y t e sw e r ea g r a n u l a ra n ds h o w e dr o u n d i s hn u c l e u ss u r r o u n d e db y r e l a t i v e l y s m a l l c y t o p l a s m ．O r g a n e l l e s a r e s p a r s e ．C o m p a r e dw i t h h y a l i n o c y t e s ，g r a n u i o c y t e sp o s s e s sr e l a t i v e l ym o r eg r a n u l e sa n do r g a n e l l e si nt h e i r c y t o p l a s m ．T w ot y p e so fg r a a u l o c y t e sc a nb er e c o g n i z e d ．S m a l lg r a n u l ec e l l s c o n t a i nal a r g ec e n t r a l l yl o c a t e di r r e g u l a r l ys h a p e dn u c l e u s ，m i t o c h o n d r i a ， s m a l lv e s i c l e s ，l y s o s o m e s ，g o l g ib o d i e s ，c i s t e r n a eo ft h ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u m 。

o s m i o p h i l i c m e m b r a n eb o d i e s ，a n dn u m e r o u sg r a n u l e so f v a r y i n ge l e c t r o nd e n s i t y ．B i gg r a n u l ec e l l sa r ec h a r a c t e r i z e db yl a r g e o s m i o p h i l i cc y t o p l a s m i ci n c l u s i o n s ． T h eB a l b ＼Cm i c ew e r ei m m u n i z e db yh a e m o c y t e so fP h a s c o l o s o —m n e s u l e n ．S p l e e n sf r o mt h ei m m u n i z e dm i c ew e r ed i s s e c t e da n dc e l l sf u s e d w i t ha nS p 2 1 0m y e l o m ac e l l l i n eu s i n gp o l y e t h y l e n eg l y c o la sf u s o g e n ． H y b r i d o m a c u l t u r em e d i u mw e r ca s s a y e db ym e a n so fe n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y s ( E L I S A ) ．Al o to fp o s i t i v eh y b r i d o m a sw e r ef o u n d a n d8o ft h e mw h i c hs e c r e th i g ht i l e ra n t i b o d yw e r er e s e r v e da t 一8 0 “ C ． E i g h tp o s i t i v eh y b r i d o m a sw e r ec l o n e d ( D B 3 、D B 5 、D C l 、D D l 、 ，2 · 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 E B 3 、E D l 、F A 4 、F C 3 ) a n da n a l y z e db yE L I S Aa n di m m u n o m a g n e t i c b e a d st e c h n i q u e s ．T h e yw e r ep o s i t i v et oh a e m o c y t ei nd i f e r e n ti n t e r f a c e s o fg r a d i e n td e n s i t yc e n t r i f u g a t i o nd e t e c t e d b yE L I S A ．M a bE B 3W a S p o s i t i v et oo fg r a n u l o c y t e ，M a bD D l 、E D lw a sp o s i t i v et op l a s m ao f h y a l i n o c y t e ．U s i n gi m m u n o m a g n e t i cb e a d st e c h n i q u e s ，M a bD D lw a s p o s i t i v et op l a s m ao fh y a l。