多重耐药大肠埃希菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究.doc

1多重耐药大肠埃希菌 16S rRNA 甲基化酶、 氨基糖苷类修饰酶基因研究【摘要】 目的 了解多重耐药大肠埃希菌(ECO)氨基糖苷类药物耐药机制方法 采用 PCR 检测 20 株多重耐药 ECO 菌 11 种 16S rRNA 甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因结果 1 株检出 16S rRNA 甲基化酶基因(5.0%)，并为新亚型；16 株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)15 号株 rmtB 基因测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库(GenBank)已登录的 rmtB 氨基酸不同，为新亚型结论 本组多重耐药ECO 菌氨基糖苷类耐药机制与产 16S rRNA 甲基化酶和产氨基糖苷类修饰酶相关多重耐药 ECO 菌存在新的氨基糖苷类药物耐药机制 【关键词】 大肠埃希菌； 16S rRNA 甲基化酶； 氨基糖苷类修饰酶ABSTRACT Objective To investigate mechanism of aminoglycoside resistance in multidrug resistant Escherichia coli. Methods The genes of 11 kinds 16S rRNA methylase and aminoglycoside modifying enzymes were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results In 20 strains, 1 strain carried 16SrRNA methylase gene (rmtB), 16 strains were positive for the genes of aminoglycoside modifying enzymes. There were changes of aminoacids in the sequence of RmtB of No.15. A significant difference was found from the rest that landed in GenBank, which identified itself as new subtype. Conclusion The aminoglycoside resistance mechanism of the Escherichia coli was closely related with 16S rRNA methylase and aminoglycoside modifying enzymes. The new mechanism of aminoglycoside resistance was discoved in multi drug resistant strains of Escherichia coli.KEY WORDS Escherichia coli; 16S rRNA methylase; Aminoglycoside modifying enzymes大肠埃希菌(ECO)是条件致病菌，对 β 内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物呈多重耐药性。

有关 ECO 菌耐药机制研究，国内报道 β 内酰胺类耐药机制较多，报道氨基糖苷类耐药机制较少，并仅限于 6 种氨基糖苷类修饰酶基因存在2情况［1～4］近年来，国外学者发现了氨基糖苷类耐药新机制——16S rRNA 甲基化酶(编码基因为 rmtA、rmtB、rmtC、rmtD 和 armA)［5～8］为尽可能了解淮安市第一人民医院 ECO 菌临床分离多重耐药株氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况，我们检测了 16S rRNA 甲基化酶与氨基糖苷类修饰酶基因rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA、aac(3) I、aac(3) II、aac(6′) Ib、aac(6′)II、ant(3“) I 和 ant(2“) I，现报告如下1 材料与方法1.1 菌株来源20 株 ECO 菌株均分离自 2007 年 1～7 月间淮安市第一人民医院住院患者标本标本来源分别为尿液 7 株、痰液 5 株、血液 5 株、脓液 3 株；患者年龄 2～75 岁，男 7 例、女 13 例全部菌株均使用 VITEK 32 全自动微生物鉴定系统鉴定菌种标准菌株为大肠埃希菌 ATCC259221.2 抗菌药物敏感性试验用 KB 法测定 18 种抗菌药物的敏感性。

根据美国 CLSI 2006 年版标准进行敏感性判断头孢哌酮/舒巴坦参照头孢哌酮20 株多药耐药临床分离 ECO 菌对 18 种抗菌药物的敏感性见表 11.4 细菌处理挑纯培养菌落置 0.5ml 离心管内(内预置 200ng/ml 蛋白酶 K 溶液 200μl)，56℃水浴 2h，改 95℃水浴 10min，加入 Chelex 100 40μl，离心(15000r/min)30s，上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用31.5 基因检测全部采用 PCR 法，靶基因引物序列和目的产物长度见表 2各种靶基因 PCR 扩增体系均为：每反应体系 P1、P2 引物各 0.5μmmol/L， dNTPs 各 200 表 1 20 株ECO 菌 18 种抗菌药物的敏感性表 2 靶基因 PCR 引物序列总反应体积 20μl(其中模板液 5μl)PCR 扩增产物500bp 热循环参数均为：93℃预变性 2min，然后93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，循环 35 周期，最后一个 72℃延长至5minPCR 扩增产物500bp 热循环参数均为：93℃预变性 2min，然后 93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环 35 周期，最后一个 72℃延长至 5min。

扩增产物作 2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，并纪录结果耐药基因检测试剂盒、靶基因 PCR 引物序列和阳性对照 DNA 由无锡市克隆遗传技术研究所提供1.6 阳性基因测序PCR 直接全自动荧光法(在美国 ABI 公司 3730 型仪上进行)2 结果20 株 ECO 菌中 rmtB 基因阳性 1 株(5.0%)；aac(3) II、aac(6′) Ib、ant(3“) I 基因阳性分别为 15 株(75.0%)、8 株(40.0%)、3 株(15.0%)，共有 16 株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)20 株 ECO 菌对氨基糖苷类药物耐药的各种相关基因存在状况见表 315 号株测得 rmtBDNA 序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的rmtB 氨基酸序列比较(Escherichia coli，登录号：ABW87619)，氨基酸序列 98%相同，能判断为新亚型，已命名为 rmtB like 并登录于美国核酸库(登录号：EU409593)图 1 为 15 号株氨基酸序列比较图43 讨论氨基糖苷类药物自 20 世纪 40 年代首次发现以来，因其抗菌谱广、疗效卓越，在医学临床和畜牧兽医业得到广泛应用。

但由于泛用和过度使用氨基糖苷类药物耐药问题随之凸现，细菌对该类药物耐药是通过表 316S rRNA 甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶 15 号株测得 rmtB DNA 序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的rmtB 氨基酸序列比较产氨基糖苷类修饰酶、细菌 16S rRNA 甲基化酶(编码基因为 rmtA、rmtB、rmtC、rmtD 和 armA)和氨基糖苷类药物作用靶位 16S rRNA 基因(16S rDNA)突变或核糖体蛋白编码基因突变所致以及细菌药物外排泵表达增强所致［9，10］，其中产氨基糖苷类修饰酶为主要原因氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)［旧称腺苷转移酶(AAD)］三类，目前已发现的有 30 余种本研究 20 株 ECO 菌株中检出 rmtB 16S rRNA 甲基化酶基因；检出 aac(3) II、aac(6′) Ib 和 ant(3“) I 三种氨基糖苷类修饰酶基因，并以 aac(3) II 和 aac(6′) Ib 为主 本组 13 株庆大霉素和/或阿米卡星耐药菌均检出 1 种以上氨基糖苷类修饰酶基因；1 株庆大霉素和阿米卡星霉素均敏感者未检出氨基糖苷类修饰酶基因；另有 3 株庆大霉素和/或阿米卡星耐药者均未检出氨基糖苷类修饰酶基因，原因可能是药物作用靶位 16SrRNA 基因(16S rDNA)突变或核糖体蛋白编码基因突变所致或细菌药物外排泵表达增强所致。

过去，药物学家通过改造老的氨基糖苷类药物的结构改善产氨基糖苷类修饰酶细菌的抗菌效能［11，12］，如在卡那霉素分子中引入保护基团以免修饰酶的修饰(如阿米卡星)；或是去除易被修饰酶修饰的基团(如地贝卡星)；或是两者同时采用(如阿贝卡星，阿贝卡星能拮抗大多数的修饰酶)现在发现 16S rRNA 甲基化酶在5细菌间快速传播将堵住通过改造老的氨基糖苷类药物的结构以拮抗修饰酶和提高抗菌作用开发新药的路子因此 16S rRNA 基因甲基化酶所致的氨基糖苷类药物耐药应引起国内同行的足够关注16S rRNA 甲基化酶在东亚(日本、韩国、我国台湾)、欧洲和南美均有报道［13］最近，我国动物医学专家报道了从猪分离到的阴沟肠杆菌中发现的 rmtB［14］日前我国从多药耐药鲍曼不动杆菌中查出 armA 型 16S rRNA 甲基化酶［15］，本文从 ECO 菌查出 rmtB 型 16S rRNA 甲基化酶为国内首次，并为新亚型我国 ECO菌临床连续分离株 16S rRNA 甲基化酶存在状况值得深入研究研究提示，本组 ECO 菌氨基糖苷类耐药机制与产 16S rRNA 甲基化酶和产氨基糖苷类修饰酶相关当然仍不能排除同时伴有氨基糖苷类作用靶位 16S rRNA 基因突变或核糖体蛋白编码基因突变以及存在多药外排机制。

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