提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤.pdf

一、提 RNA 】一、实验准备：1、试剂： 75% 乙醇、 Trizol、1.5mL 进口 EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用 ) 、2、配 75% 乙醇 (DEPC水+无水乙醇 ) ，放 -20 ℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP 管用的 ) ；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、 1mL/孔 PBS 洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL 枪吸尽 PBS ）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min 左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口 EP管；05、加入 100μL 氯仿 ( 即 1/5 体积的 trizol)；06、 4℃离心机， 12000g， 15min；07、吸 200μL( 可减少 ) 上清放入新的1.5mL 进口 EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、 4℃离心机， 12000g， 10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的 75% 乙醇剧烈混匀；11、 4℃离心机， 7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的 75% 乙醇，混匀；13、 4℃离心机， 7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min ，用针头或者200 微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40 μ-60 μL) 的 DEPC 水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21 楼测 RNA浓度，带DEPC 水、灭菌的dd 水、 10 微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在 -20 ℃冰箱。

但长时间(>24h) 保存，需要放在-80 ℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA ，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测 RNA 浓度】一、实验准备：01、先知楼21 楼-2109 教室，一个冰盒+DEPC 水+10 微升枪、灭菌dd H2O、10μL 枪头 (RNA专用 ) 、本子 +笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑 ==>打开“ N”软件 ==>点击“ Nucleic acid”==>选择“ OK ”==>选择“ RNA ”；03、灭菌 dd H2O清洗 2-3 遍，擦干；04、 DEPC 水 校零：即加DEPC 水一滴，点击“Blank ”，擦干；05、测 RNA ：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（ 0.1 请注意，这个值跟仪器无关， 核酸的吸光度必需大于 0.1 ，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值加 1 号试剂（ 2μL）==>加 3 号试剂 (0.5 μL)==>加 4号试剂 (0.5 μL)==>加 2 号试剂 (0.5 μL)==> 加 RNA==> 离心 ==>上机；02、上机： OPEN==> 点击“ User”菜单下的“ clx ”，点击“ Accept ”==>选择“ run ”下面的到“ exp001 rt”==>修改体系“ 10μL”( 默认为 25 微升 )==>点击“ Start ”，进入界面；03、 37.0 ℃ 15min==>85.0 ℃ 5s==>4.0 ℃ 60min ；04、 4℃冰箱 保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR 】一、实验准备：01、试剂： Roche 的 SyBr Green(rox) 02、 1.5mL EP 管、 0.2mL EP 管、 96 孔板 / 八连冠； 10μL、 20μL、100μ L、200μL、2.5 μL、1000μL 枪；03、冰盒一个、Rox化冻 ( 避光 ) 、引物化冻（GAPDH ）、 cDNA 、 DEPC 水；二、操作步骤：01、 Rox 10μL；+ dd H2O 6 μL；+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2 ------------20μ L体系02、计算：每个样，X个抗体 (至少包括GAPDH- 内参 , 还有目的 ) ，三个副孔。

即如果六个样，2 个抗体 (GAPDH,PLK1)，三个副孔6*1*3=18 ≈ 20(PLK1) ，6*1*3=18 ≈20(GAPDH) ；1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 6/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAPPLK1 Rox：10*20=200 μL DEPC水： 6*20=120 μL F：1*20=20μL R：1*20=20μL GAPDH Rox：10*20=200 μL DEPC水： 6*20=120 μL F：1*20=20μL R：1*20=20μL 03、稀释 cDNA 10倍(18 μL DEPC水+2μL)==> 配置 Mix(Rox+ DEPC 水+F+R)==>加样 ( 一横排先加 18μL mix(GAPDH)，随后加入18μL mix(PLK1) 。

随后六个孔加同一个cDNA ；06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡如果有气泡，弹开，随后>2000rpm 离心，时间不定 (5s 即可 ) ；07、上机 +设置程序：A、双击打开程序“StepOne Software v2.1 ”==>点击“ OK ”==>点击“ Ignore 1.5;3;6;9;12)，则点击“Add New Sample ”，出现“ Sample 1 、Sample 2 、 Sample 3 、Sample 4 、Sample 5 、Sample 6 ”六个==>将其重命名；Plate Setup界面 - Assign Targets and Samples界面 ：GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6PI3K/5PI3K/5PI3K/5PI3K/6PI3K/6PI3K/6D、Run Method 界面：设置温度；随后修改“Reaction Volume Per Well”，将其改为“20μL 体系 ”；E、点击“ Start Run”三、注意事项01、 注意一定要禁止气泡。

吸液体时，观察枪头中有没有气泡和液体；打加入液体时，延管壁加入，枪头只能打到第一档，随后观察枪头有没有打尽；02、加入引物时，一定要涡旋混匀；03、 Rox 加入后，一定要避光；04、加入的液体一定要等量；。