生物化学：11 Replication(111-5).ppt

Chapter 11 DNA Replication and Repair,要求,1. 掌握遗传信息传递的中心法则 2. 掌握DNA复制的一般规律：DNA半保留复制、半不连续复制 3. 了解大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性，原核生物DNA的复制过程 4. 了解引起DNA损伤的因素，DNA损伤的修复机制,大肠杆菌 遗传图谱参与复制的基因,DNA生物合成的两种方式： DNA复制和反转录 DNA体内复制涉及： 原核、真核生物的染色体 细菌质粒（环状，双链） 真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体） 病毒（双链，环状） DNA的体外复制：DNA分子克隆,1958年F.Crick提出中心法则 以DNA分子为模板，合成出相同DNA分 子的过程 B. 以某一段DNA分子为模板，合成出对应的 RNA分子的过程 C. 以 mRNA为模板，根据三联密码规则， 合成对应蛋白质的过程中心法则揭示了遗 传信息的传递方向,中心法则,中心法则,第一节 DNA的复制,一、DNA半保留复制 1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli.DNA，证明了DNA的复制是半保留复制即每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。

半保留 全保留 随机保留（如果是这两种复制方式， 实验将结果如何）,Semi-conservative replication,1963年，Cairns用放射自显影法在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E.coli染色体DNA 3H-脱氧胸苷标记E.coli.DNA ，经过将近两代时用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli.DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H放出的粒子还原银，在光学显微镜下观察Semi-conservative replication,复制中的大肠杆菌染色体,2复制起点、单位和方向 复制起点 多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段富含A.T 环状DNA复制起点的确定方法： 在一个生长的群体中，几乎所有的染色体都在复制过程中复制起点的确定,复制单位 复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子含有一个复制起点 环状双链DNA只有一个复制起点，它们都是单复制子 真核染色体DNA有多个复制子，每个复制子约有100-200Kbp 在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程复制方向 定点起始，复制方向大多数是双向的，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。

等速进行 双向进行 定点起始 异速进行 单向进行,放射自显影判断DNA的复制方向及速度： 低放射性3H-脱氧胸苷，高放射性3H-脱氧胸苷 a. 单向，b. 双向等速， c. 双向异速 三种结果图形 E.coli.的一个温度敏感株，在42时，能使DNA在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25时复制功又能能恢复复制的方向,3复制方式 直线双向复制 单点，双向，T7 多点，双向，真核染色体DNA 型复制 单向，双向（E .coli.） 滚环复制 单链，环状，x174 D环复制 线粒体，叶绿体 多复制叉复制 E.coli.富营养时，采取多复制叉复 制方式E.coli.DNA复制速最快可达50000bp/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂复制方式-1,复制方式-2,复制方式-3,4. 半不连续复制 所有DNA聚会酶催化反应的方向是53 1968年，发现冈崎片段 细菌长: 1000-2000bp 真 核: 100-200bp，约等于一个核小体DNA 的长度,复制叉,DNA replication,二、DNA合成反应,生物合成53 ，化学合成35 1反应必备条件 DNA模板(反转录时用RNA模板) 引物 (DNA、RNA或蛋白质) DNA聚合酶 4种dNTP Mg2+,2聚合反应过程及特点 总反应式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP + DNA dGMP DNA n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP,DNA链的延长反应,DNA聚合酶反应特点: 以4种dNTP为底物 反应受模板指导 需有引物3-羟基存在 链生长方向5 3 产物的性质与模板相同,3几种由DNA聚合酶催化的DNA合成反应,三、与DNA复制有关的酶及蛋白质 有30多种酶及蛋白质参与DNA复制 1原核DNA聚合酶（E.coli.） E. coli. DNA pol. I 单体酶，分子量103000，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol. 催化活性：5 3 聚合活性 3 5 外切活性 5 3 外切活性,用蛋白水解酶将DNA pol.部分水解可得： 大片段（Klenow） 5 3 聚合活性 3 5 外切活性 小片段 5 3 外切活性 Klenow片段的用途： a.补齐DNA 3隐缩未端 b. 标记DNA片段未端 ccDNA合成第二链 dDNA测序, E.coli. DNA Pol. 分子量88000， 催化活性: 5 3聚合 3 5外切 无5 3外切活性 E.coli.DNA pol. 寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成、和三种亚基组成核心酶。

E.coli.DNA pol.,DNA pol.是合成新链DNA主要的酶，又称 复制酶（Replicase） 53 外切酶活性只作用于单链DNA DNA聚合酶有6个结合位点 模板DNA结合位点， 引物结合位点 引物3，-OH位点、反应位点 底物dNTP结合位点 5 3 外切位点（pol.没有） 3 5 外切位点（校正）, DNA聚合酶和 1999年发现，参与DNA的错误倾向修复 当DNA受到严重损伤时，可诱导合成这2种 酶它们能使修复缺乏准确性2. 真核生物DNA聚合酶 （1）DNA聚合酶 合成引物 （2）DNA聚合酶 修复DNA损伤 （3）DNA聚合酶 线粒体DNA的复制 （4）DNA聚合酶 核DNA的复制,3引物合成酶 DNA的复制需要RNA引物，引物合成酶可合成10-60个碱基的RNA引物 4解螺旋酶 解螺旋酶、与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开5DNA旋转酶 属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的拓扑张力 6Single-Strand Binding Protein （SSB） 复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的SSB与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。

7DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的 切口E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源，T4DNA ligase可以连接平头双链DNADNA连接酶（ligase）,四、DNA复制过程（E.coli.） 1. DNA合成的起始 起始阶段是复制调节的唯一阶段 E.coli. DNA复制起点（ori C）， 由245 bp组成 在5端有3个13 bp重序列，在3 端有4个9 bp重复序列大肠杆菌DNA复制起点,复制的起始,复制的起始,大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质,大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质功能： DnaA 在原点特定位置打开双螺旋 DnaB 使DNA解旋 DnaC DnaB结合在原点所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成RNA引物 SSB 结合单链DNA RNA聚合酶 促进DnaA活性 旋转酶 松驰DNA扭曲应力,20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物 三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物 DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链2DNA链的延长反应 前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.催化。

3RNA引物的切除及缺口补齐 DNA pol的5 3外切活力，切除RNA引物 DNApol的5 3聚合活性补齐缺口4DNA切口的连接 DNA ligase，真核细胞由ATP提供能 量，原核由NAD提供能量 5DNA合成的终止 环状DNA、 线性DNA，复制叉相遇即终止 DNA复制体结构（图）,DNA复制小结： DNA解螺旋酶解开双链DNA SSB结合于DNA单链 DNA旋转酶引入负超螺旋，解除超绕 DNA引物合成酶合成RNA引物 DNA pol.在两条新生链上合成DNA DNA pol切除RNA引物，并补齐DNA DNA ligase连接一个冈崎片段到后随链上,DNA复制过程中，聚合酶对dTTP与dUTP的分辨能力不高，有少量dUTP掺入DNA链中 此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基五、真核生物DNA的复制 真核生物DNA复制叉移动的速度比原核的慢，如哺乳动物复制叉的移动速度每分钟1000-3000bp，细菌的每分钟50000bp 真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。

真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点1复制过程中组蛋白的装配 核小体的结构（200bp左右） 真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白八聚体直接转移到子代前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体 DNA是半保留复制，组蛋白全保留复制时组蛋白的分布,2真核生物DNA复制的终止 端粒：一段DNA序列与蛋白质形成的复合体，是真核细胞染色体末端特有的结构 功能： 保证线性DNA完整复制 保护染色体末端 决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶， 体细胞不表达端粒酶端粒（telomeres）分布于真核染色体未端 酵母端粒约100bp的重复序列，形式为： 5，（TxGy）n 3，（AxCy） n x和y 一般为1-4 端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端端粒酶含有RNA和蛋白质（DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约159b，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板 端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。

人类体细胞的端粒长度，随年龄增加而逐渐缩短细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂 若能重建端粒，则细胞可以永远分裂恶性肿瘤细胞端酶表达量多六、DNA复制的真实性 体内DNA复制具有高度真实性，每复制107-1011个碱基对出现一个错误 碱基对的自由能在4-13KJ/mol，相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2 1DNA聚合酶的碱基选择作用 酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP停留时间长，而参与聚合 酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同DNA聚合酶能根据模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板引物，另一种是dNTP DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。

235外切活性的校正阅读 E.coli. DNA pol.和pol.有35外切活性，可删除错误插入的核苷酸 缺失35外切活性的E. coli. DNA pol.，催化DNA合成时，出现错误的频率增高5-50倍 35外切活性可以使DNA复制的真实性提高10-1。