生物分析方法验证-7.pdf

生物分析方法验证康利华咨询服务有限公司内容简介背景分析方法选择分析方法验证分析方法确认背景什么是分析方法• 安全、有效和质量可控是对药品的三个基本要求，为 保证上述要求，需要设定合适的质量标准分析方法 就是为完成质量标准中的检测项目而建立的测试程序， 包括但不限于分析原理、仪器参数、试剂、系统适用 性试验、对照及样品制备过程、测试程序、计算公式、 校正曲线的建立等背景满足现实需要 评价药品的质量属性需要准确一致的分析数据而准确 一致的分析数据只能通过实验室研究来获得 准确可靠的分析方法是实验室质量系统不可分割的一部 分符合法规要求 • TGA GMP（PIC/S GMP） • 21 cfr part 210.211 • 中国GMP2010版 • EU GMP、WHO GMP etc…方法的准确性和可靠性如何保证或评价？ • 验证 • 确认背景定义 • 验证：通过实验室研究来获得客观证据，以证实分析 方法的分析性能适用于预期用途，并用文件记录来证 明的过程 • 确认：通过实验室研究来获得客观证据，以证实标准 方法在特定实验室应用时方法的状态未发生漂移的证 据，并用文件记录来证明的过程。

区别 • 验证：用已知的样品及环境挑战未知的方法，关注于 方法的有效性与可靠性 • 确认：用已知的方法挑战未知的样品及环境，关注于 方法在实际条件下的适用性分析方法应用分析方法应用基于方法的法律效力而选择 • 标准方法确认，必要时验证 • 文献方法 验证或验证：根据该方法的用途 • 新建方法全验证分析方法应用分析方法应用标准方法标准方法是那些由国际、地区或国家标准发布组织公布的 分析方法 在制药行业中，这类方法由于受到法规的认可而具有一定 的法律效力，又称为认可方法 由于法规认可等原因，国家间标准方法的范围可能会有所 不同 TGA： TGO→ BP →EP → USP→ JP FDA：USP-NF、、国际官方分析化学协会（AOCA）、 已批准的NDA/ANDA中的方法 中国：《中国药典》、部颁标准、局颁标准、分析方法应用分析方法应用文献方法 • 在专业杂志或书籍上发表并介绍的方法 • Case by case分析用途与书籍介绍的分析物一致：确认书籍介绍分析物的类似物：验证分析方法应用分析方法应用新建立方法 • 无标准方法 • 有分析方法，但是方法无法律效力 • 企业自己开发的分析方法 • 根据标准方法修订的方法分析方法应用分析方法应用什么时候进行验证什么时候进行验证• 开发的新方法 • 方法发生了变更 • 测试样品的显著变化引入新的分析物，基质变化，等等… • 偏差调查OOS结果的根源是由于验证的不彻底分析方法验证分析方法验证的五大要素分析方法验证的五大要素• 科学理解 • 预期用途 • 法规要求 • 风险评估 • 文件化分析方法验证科学理解 •产品特性•方法原理及特性分析方法验证科学理解（续） •血液制品的特性相对分子量大结构多样性及多变性 •不同构型/构象，活性差别极大稳定性要求高：易受酸、碱、温度等因素影响基质复杂，干扰多产品的功效是通过生物活性来评价的 •分子结构相同，构型或构象不同，未必有效分析方法验证科学理解（续） •生物分析方法类型化学结合酶联免疫细胞测定动物实验分析方法验证科学理解（续） •化学结合基于产品与某种物质的结合特性或化学原理精确、稳定：5-20%不是基于生物活性的分析方法多用于中控，或清洁验证分析方法验证科学理解（续） •E反应实验体外促进E分子活化本身具备E活性通过底物变化监测E活性较为准确：20%分析方法验证科学理解（续） •细胞测定诱导细胞产生可测定的应答 •细胞反应：聚集、裂解、融合，etc…… •分泌化学物质可变性较大：30%分析方法验证科学理解（续） •化学结合实验动物与参照动物的对比 •使用标准品的 •为经处理/免疫的较高的变异性：50% •需要饲养、管理、操作动物 •动物间较大的差异性分析方法验证参照相关指南要求参照相关指南要求 • EDQM/FDA/ICH按按预期用途分为预期用途分为4类类 • 鉴别： • 杂质定量限度 • 含量 •特殊试验分析方法验证参照相关指南要求参照相关指南要求 • WHO按按预期用途分为预期用途分为4类类 • 鉴别： • 杂质定量限量分析 • 效价测定 • 组成测定分析方法验证分析性能（理化）专属性准确性精密度 • 重复性进样精密度测试重复性 • 中间精密度 • 重现性定量限检测线线性范围耐受性分析方法验证分析性能（生物分析）专属性（特异性）准确性精密度 • 重复性 • 中间精密度 • 重现性定量限检测限线性和测定范围耐用性分析方法验证（理化）验证内容鉴别杂质检查含量定量限度准确度否是否是重复性否是否是中间精密度否是否是1专属性是 2是是是5检测限否否 3是否定量限否是否否线性否是否是范围否是否是耐受性否是否3是1：已经论证了重现性，可不再论证中间精密度。

2：如一分析方法缺少专属性的 话，可用另一分析方法作为补充3：有些情况下需要4：有些情况下不需要5： 如含量方法缺乏专属性，可使用具有专属性的杂质测定方法作为补充法规要求（中国及EDQM）分析方法验证（理化）验证内容鉴别杂质检查含量特定实验定量限度准确度否是否是是4重复性否是否是是4中间精密度否是否是1是4专属性是 2是是是5是4检测限否否 3是否否定量限否是否否否线性否是否是否范围否是否是否耐受性否是否3是是41：已经论证了重现性，可不再论证中间精密度2：如一分析方法缺少专属性的 话，可用另一分析方法作为补充3：有些情况下需要4：有些情况下不需要 5： 如含量方法缺乏专属性，可使用具有专属性的杂质测定方法作为补充法规要求（FDA）分析方法验证（生物）验证内容鉴别杂质检查效价测定组分测定定量限度准确度否是否是是重复性否是否是是中间精密度否是否是是专属性（特异性）是是是是是检测限是否是否否定量限否是否否否线性否是否是是范围否是否是是耐受性是是是是是法规要求（WHO）：分析方法验证专属性专属性 • 定义：在其他成分可能存在下，方法能够正确测定出被测物的特 性；根据检测项目的不同，还应该具有不同的要求。

• 鉴别反应 应可以区分出结构类似的化合物含有被测成分的供试品应呈正反应；不含被测成分的供试品， 以及结构类似物或组分中的有关物质，均应呈负反应免疫印迹法（重组干扰素） • 电泳→电转移 →E免疫定位 • 使用的检测抗体的特异性确认 • 排除其他理化特性类似组分的干扰分析方法验证专专属性（续）属性（续） • 杂质 采用的分析方法能精确测定被测物含量，且可以区分出不同的目 的物浓度之间的差别 • 含量测定 在杂质或辅料存在的情况下，被测物的含量或是效价测定结果应 不受任何影响可加入已知量的杂质或取经过强制降解实验的样 品，进行测定，杂质峰应与主峰基线分离且相关杂质峰在主峰处 没有干扰 • 必要时应结合准确度验证评价专属性-即区分不同浓度样品的能力 • 色谱方法 色谱峰保留时间及峰形峰形的一致性分析方法验证准确度：准确度：实测值与真值的接近程度• 评价方式评价方式选择1 • 使用已知纯度的标准品 • 制备空白基质，将已知量的被分析物添加至空白基质中 • 空白基质不可得：标准曲线法选择2 • 将结果与准确度已知的方法的结果进行比较选择3 • 推论而得：精密度、线性、专属性分析方法验证影响准确度的因素影响准确度的因素• 方法选择性杂质干扰，如专属性中，色谱峰达到基线分离 • 回收率样品制备损失 • 参考物质的含量不准标准品分解使用过期对照etc……分析方法验证准确度（续）准确度（续） • 对于生物要来说，准确度不太实用。

• 生物制品一般采用标准曲线法使用对照品制成标准曲线样品检测效价计算 • 关键的是标准曲线和样品曲线的拟合性分析方法验证准确度准确度: 基质加样法进行准确度测定基质加样法进行准确度测定分析方法验证准确度（续）准确度（续） • 免疫分析3个不同浓度测试物至空白中每一浓度2份样品每份样品重复测定3次比较测定值及真实值计算偏差分析方法验证检测限与定量限检测限与定量限• 检测限指在规定试验条件下，被测物能够被检测出的最低量，但 是无须定量检测限通常以被测物的浓度表示 • 定量限系指在规定的实验条件下，试样中被测物能被定量测定的 最低量，其测定结果应具有一定准确度和精密度定量限以被测 物浓度表示确定方法 • 直观法 • 信噪比法 • 根据响应值的标准差和斜率空白的标准差根据校正曲线分析方法验证直观法 非仪器分析方法 通过对一系列已知浓度被测物的试样进行分析，并以能准确、 可靠检测出或定量被测物的最小量或最低浓度来建立信噪比法 能显示基线噪音的分析方法（如HPLC、GC） LOD: 3：1 LOQ：10：1 较差的可操作性:影响因素多，重现性差 仪器状态：检测器能量衰减造成仪器灵敏度下降 不同检测器的噪声水平 试剂：不同的空白背景……分析方法验证根据响应值的标准差和斜率 • 空白的标准差适用于空白浓度为0测定空白，并计算空白响应值的SD。

根据SD，在校正曲线上进行计算，求出LOD/LOQ • 根据校正曲线适用于无法获得不含分析物的空白测定空白，并计算空白响应值的SD根据校准曲线，计算3SD或10SD所对应的浓度LOD=空白+3SDLOQ=空白+10SD分析方法验证NoiseLOD信噪比信噪比 = 3:1LOQ信噪比信噪比 = 10:1信噪比法确定方法的LOD、LOQ不同检测器的检出限和定量限数据检测器A检测器B检出限0.16%0.05%定量限0.21%0.07%方法研究阶段使用检测器与方法应用阶段检测器的灵敏度和 噪声水平会存在不同在设定检测限与定量限时应考虑检测 器灵敏度的影响分析方法验证确定检测限时，一般根据其他验证研究，如准确度图谱的 信噪比推断其大致的检测线浓度，配制溶液并进样三次， 信噪比应都大于3：1定量限应具有一定的仪器和方法精密度，这是在确定定量 限时应特别注意的 推荐的实验设计是平行制备6份溶液，浓度范围自预期的 定量限（一般根据其他验证研究，如准确度图谱的信噪比 推断而来）至其20倍浓度，所有样品均进样6针，计算各 浓度梯度下含量的标准偏差，并以标准偏差对含量做图 （见下图），选择偏差在可接受标准范围内的浓度作为定 量限。

定量限表示为：LOQ=XXXmg/mL（RSD≤YY%）分析方法应用分析方法验证线性与范围线性与范围 • 线性指测试结果与试样中被测物浓度呈正比关系的程 度 • 根据线性的测定，确定检测方法的范围，一般以相关 系数r和测定系数R2表示 • 测定的线性范围取决于分析方法的目的化学测定≥0.99生物学活性≥0.9分析方法验证线性与线性与范围（续）范围（续） • 范围系指能够得到满意的精密度、准确度和线性的， 高低限浓度或量的区间 • 自线性研究中获得 • 在范围的区间边缘，均可得到满意的精密度、准确性 和线性 • 依赖于分析方法的类型及应用 • 同时还基于产品的特性分析方法验证范围范围 • 含量含量/效价效价纯品：纯品：80～～120%生物学活性：生物学活性：70～～130%特殊特殊方法（如动物实验）：方法（如动物实验）：±±100% • 含量均一度含量均一度测试浓度的测试浓度的70～～130% • 溶出度溶出度溶出限度溶出限度Q-20%～～标示量的标示量的 120% • 杂质杂质报告限报告限～～120% 限度值限度值 (测试浓度的测试浓度的API存在下存在下) • 含量含量&杂质杂质报告限报告限～～120%含量标准值含量标准值分析方法验证线性与线性与范围（续）范围（续） • 常用的评估方法是制备5～6份溶液（或者6-8份），分别标识， 溶液的梯度。