荧光定量PCR引物设计要求 (2).doc

荧光定量PCR引物设计要求荧光定量PCR引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳5.碱基要随机分布，尽量均匀6.引物自身不能有连续4个碱基的互补7.引物之间不能有连续4个碱基的互补8.引物5′端可以修饰9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)10. 引物3′端要避开密码子的第3位11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源15.查看有无假基因的存在假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

16.TM值在58-62度之间17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'5' GACCACAAAGTCAGCCCCAG 3'ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'5' CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG 3'5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'5' GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC 3'5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'5' GACCCTCAACAATGCCAAACC 3'5' CAACGAGAAGGAATACACACC 3'5' ACCCTCAACAATGCCAAAC 3'TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-qF 5' GTCAACGAGAAGGAATACACACC 3'TKGAPDH-qR 5' AGACCCTCAACAATGCCAAAC 3'2. 156bp ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-QF 5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'TKGAPDH-QR 5' AACAGTCTTTTGAGTGGCAGCC 3'。