对外周血单个核细胞分离方法探.doc

对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚2004-7-24 17:06:00中华现代临床医学杂志2003年11月第1卷第9期【摘要】口的探讨外周血单个核细胞(PBMC)的不同分离方法对分离效果、贴壁能力 以及淋巴细胞的增殖活性的影响方法取肝索抗凝血，分别用紀乙基淀粉(hydrixyethylstarch, HES)自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficol 1密度梯度离心法三种 方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer, CIK)培养结果 HES 自然沉降法、HES 离心沉淀法、Ficol 1 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85. % 结论 轻乙基淀粉离心沉 淀法可有效地分离PBMCo关键词轻乙基淀粉 淋巴细胞分离液单核细胞Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cel 1sHanYaping, Liu Yuan, Zhang Lili, et al・Deparment of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University, Nanjing210029.[Abstract] Objective To investigate the differenee among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) through observing the re covery rate, the adherent ability and lymphocytes proliferation ac " tivity of t he isolated PBMCs. Methods Use three different isolation protocols, HES (hydrixy e thylstarch) sedimentation method, HES centrifugation method and Ficol1 density gradient centrifugation, to isolate PBMCs from healthy donors. Then compare thes e isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs, the number of plastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation. Resul ts The recovery rate of PBMCs is86. 4%by HES sedimentation method, 83. 7%by HES c entrifugation and sedimentation method and85. l%by Ficol1 density gradient ccntr ifugation [method] separately. Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.Key words hetastarch ficoll monocyte外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少 量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。

为此, 我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,对不同方法获取PBMC的贴 壁能力和C1K细胞增殖活性等作一较为系统的探讨1材料和方法1. 1材料 外周血:健康成人外周血10份Ficoll :±海试剂二厂，分子量400000c 6%H ES: DUPONT公司生产，分子量480000c1.2方法1.2.1外周血单个核细胞的分离HES自然沉降法tl]:即肝素抗凝血与6%HES按5:1混 合,自然沉降60min,取上层液400Xg离心10min,以RPMT1640洗两遍备用HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1,使HES终浓度为 0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和 3.0%条件 F20°C60Xg 离心 lOniin,取上层液400Xg离心lOmin,以RPMI1640洗两次备用Ficoll密度梯度离心法 ⑵：肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋 巴细胞分离液600 Xg离心20min,小心吸取小个核细胞层，以RPM11640洗两遍备用1.2.2 PBMC的处理将不同分离方法获取的PBMC计数厉重悬于完全培养基中，分别加入 24孔培养板，每孔4X10 6细胞，37°C, 5%C0 2培养2h后吸取培养上清，用RPMI1640轻 轻洗涤培养孔3次以去除非贴壁细胞。

收集贴壁细胞计数并用荧光素标记的单克隆抗体通过 荧光激活细胞分离器(FACS Vantage SE)鉴定悬浮细胞川完全培养基调整细胞浓度至1 X10 6 /ml,补充适量的CD3单抗、rh-lFN.儿-2等，共同培养多种细胞因子诱导的杀伤细 胞(CIK),每3天换液1次并计数，笫10天收获细胞，计算增殖倍数，同时以荧光素标记 的单克隆抗体鉴定细胞类型1. 2. 3统计学方法 应用SAS6. 12统计软件进行方差分析、t检验数值以平均数土标准 差表示2结果2. 1不同分离方法PBMC回收率HES终浓度在0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2. 0%和3. 0% 条件下进行离心沉淀和白然沉降，结果显示HES终浓度>1.0%吋PBMC冋收率最高，为此我 们饰定HES终浓度1. 2%为最后•实验浓度J|J HES离心沉淀法和自然沉降法分离的PBMC总数 相近，与传统的Ficoll密度梯度离心法比鮫也无统计学差显(P>0.05),结果见表12.2不同分离方法PBMC贴壁能力HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficol 1分离法其 CD14 +细胞FACS检测平均百分率分别为38.69%、68.70%、64. 54%, IIES自然沉降法明显低 于后两法(1X0. 01) , HES白然沉降法中含有较多的CD3、CD19、CD56细胞见图1。

2. 3不同分离方法PBMC增殖活性HES自然沉降法、HES离心沉淀法利Ficoll分离法所 获得PBMC,其CIK细胞增殖能力接近,第10天略有差别但无统计学差异(P>0.05)见图图1不同分离方法PBMC的贴舉能力略图2不同分离方法CIK细胞增殖能力的比较略表1不同分离方法PBMC冋收率略3讨论分离PBMC是一•项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性 强的液体，其比亜为1.077,在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒 细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上操作时需将抗凝血作适当稀释, 比较适用于少量血液的分离，在血量较多吋要分成数管进行离心，十分不便，而口重复多次 地开放性操作也增加了污染机会HES是一种血浆代用品［3］，原料来口于天然绿色植物玉米，rh高分子量支链淀粉经降 解、疑乙基化并进一步加工处理后制成HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以 凹面相贴，重叠在一起的红细胞下沉阻力减少，红细胞与血浆及单个核细胞形成清晰的界面 抗凝血与终浓度为1%〜2%的HES混合后经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核 细胞的血浆层，使PBMC的分离过程简单化，有利缩短工作时间，提高工作效率。

此外，用 HES分离PBMC也口J在封闭系统中即血袋中进行［1］,非开放性操作町减少污染机会与F icoll法相比HES离心沉淀法除简化了操作外，也减少了耗材，降低了试验成本 ⑷Denning ［5］等川HES沉降法分离脐血单个核细胞发现，脐血单个核细胞的冋收率可受 分离前脐血放置时间和温度的影响我们将新鲜采集的血液与HES混匀后常温(22°C〜25°C ) 静置60min获取的PBMC,其细胞活率及贴建能力都低于HES离心沉淀法，不规则细胞形态 增加，是否与细胞在相对高浓度的HES中浸泡时间过长有关，还有待于观察将肝素抗凝血 与HES在离心管中按最适比例混匀后 直接60Xg离心lOmin,所得到的细胞数量与其他方 法相近(见表1),无统计学差异，而形态学和贴壁能力明显好于HES自然沉降法(P<0.01)oHES有髙、中、低三种分子量，不同的分子量其分离效果各有差异［6\因此，选择合适的HES浓度和分子量可以确保分离效果总之，在获取PBMC时应根据血量多少和实验室的条件來选择不同的分离方法本实验 室用6%HES离心沉淀法分离的外周血单个核细胞冋收率为86. 0%,活细胞在97%以上在综 合细胞纯度、细胞回收率、细胞活力以及操作的难易程度等因素，笔者认为HES离心沉淀法 不失为分离PBMC首选的方法0—。

参考文献1 Rubinsten P, Taylor PE, Scaradavou A, et al. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution:organization of the placental blood pro ~ gram. Blood Cells, 1994, 20:587-600.2北京医学院微牛物学教研组编.实验免疫学.北京：人民卫牛出版社，1980, 435-436.3 Forster H. Physical and chemical properties of hydroxyethy1starch. Plas - ma Volume Expansion, 1992, 105-121.4 Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfield RE, et al. Processing and cryop - reserv ation of pl acental/umbi]ical cord blood for unrelated bone marrow reconstitutio n. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92:10119-10122.5 Derming-kendal1 P, Donaidson C, Nicol A, et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking. Exp Hematol, 1996, 24:1394-1401.6 Kenichi S, Mikitomo Y, Ryo S, et al. Cell processing for。