EAE发病机制中MALT1、IL―17作用的探讨.doc

EAE发病机制中MALT1、IL-17作用的探讨【摘要】目的：通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型，观察小鼠脑组织中黏膜相关淋巴组织淋 巴瘤转运蛋白1与血清白介素T7 （Interleukin-17）的表 达情况，并探讨两者在EAE发病机制中的作用进一步探究 MALTI是否可以作为多发性硬化（MS）的治疗靶点，以便寻 找治疗MS的新手段方法：将36只C57BL/6雌性小鼠按照 随机数字表法分为EAE组和佐剂组各18只，EAE组采用MOG 与完全弗氏佐剂的沫状混合物制备EAE模型，佐剂组仅给予 弗氏佐剂观察每只实验动物发病情况并每隔2 d进行一次 神经功能评分分别于免疫后14 d、24 d、40 d两组小鼠 随机各取6只，心脏取血并4%多聚甲醛灌注取脑组织取小 鼠脑组织石蜡切片，免疫组化方法检测各组小鼠脑组织中 MALT1并用ELISA法检测血清IL-17表达结果：EAE组与 佐剂组的小鼠神经功能评分、体重、血清中IL-17含量和脑 组织中MALT1蛋白阳性细胞数比较差异均有统计学意义（P0. 05）具有可比性1. 2 EAE 模型制备 用 0. 01 mol/L 的 PBS 将 M0G35-55C 武 汉博士德公司）稀释。

然后将稀释液与等量含结核分枝杆菌 的完全弗氏佐剂（武汉博士德公司）混合，用玻璃注射器抽 吸成油包水状，制成诱导EAE的抗原乳剂EAE组小鼠背部 中央偏头侧皮下点注射抗原乳剂利用生理盐水代替 M0G35-55稀释液参照上述方法制备乳剂，供对照组使用各 组于免疫后第0天、第2天分别进行腹腔注射百日咳毒素（美 国Sigma公司）600 ng/只作为免疫增强剂1.3数据采集小鼠经M0G免疫后第8天开始，隔日采 用盲法由两名观察者称量并记录每只小鼠的体重，采用国际 通用的5分评分制对小鼠进行神经功能评分评分标准：0 分，无任何症状；1分，尾部张力消失，可见轻度步态笨拙; 2分，一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复；3分，双后 肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4 分，双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分，濒死状态或死亡症 状介于两者标准之间者以±0.5计1.4小鼠组织提取 分别于免疫后14、24、40 d,于EAE 组与佐剂组中随机抓取各6只小鼠（即14 d组、24 d组、 40 d组），用10%水合氯醛0.1 inL/20 mg腹腔注射麻醉后， 小鼠左心取血并编号，左心室灌注磷酸盐缓冲液至肝脏变 白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大脑并编号。

1. 5 ELISA法检测血清IL-17小鼠血液离心后取血清零 下70 £保存，IL-17的浓度采用上海西唐生物科技有限公 司的ELISA试剂盒，具体方法参照试剂盒说明书参照各因 子的标准曲线计算其含量，结果以pg/mL表示1.6免疫组化 小鼠脑组织提取后于4%多聚甲醛中浸泡 过夜，并脱水，石蜡包块，MALT1抗体(1抗、2抗)购自武 汉博士德公司参照试剂盒说明书操作，并在相关技术指导 老师指导下进行1. 7统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件对所得 数据进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t 检验，多组间参数比较采用单因素方差分析，检验水准 a=0. 05,以P0.05)佐剂组中两两比较差异均无统计学意 义(P〉0.05), EAE组与佐剂组比较差异均有统计学意义 (P0. 05),而EAE组各小组与佐剂组比较差异均有统计学意 义(P0. 05),而EAE组各小组与佐剂组比较差异均有统计学 意义(P〈0.05),见表23讨论MALT1作为NF-kB通路的一个激活成分，神经系统内 NF-kB主要存在于神经元、血管内皮细胞及胶质细胞， NF- k B是调控炎性反应的重要信号系统，在EAE免疫调节及 炎性反应发展中有重要意义［7, 9］。

该信号系统能调控多种 黏附分子、生长因子、细胞因子以及急性期蛋白的表达，并 在炎性反应和免疫诱导、细胞增殖和分化等EAE多种病理过 程中发挥重要作用此外NF-kB可促进黏附分子表达，介 导外周炎性细胞进入脑组织［10］MALT1基因剔除法表明， MALT1的支架功能在T细胞抗原受体(TCR)信号刺激的下游 NF-kB活化中是必不可少的［ll］o其蛋白酶活性对成熟的NF-kB反应也是相当重要的，该反应决定了 T细胞活化的程 度［⑵有研究发现，炎性细胞Thl7被认为是诱导EAE的主要 反应细胞，而Thl7细胞产生致炎性细胞因子IL-17,其具有 强烈的致炎作用，从而引起中枢神经系统脱髓鞘病变［5］ 本实验结果显示，MALT1阳性细胞数较多时，该小鼠血清中 IL-17的含量也较高，同时其肢体功能障碍也较严重，这些 结果提示MALT1可以促使IL-17的分泌本结果可能与MALT1 激活NF-kB通路，导致ThO细胞向Thl7细胞分化有关本 实验结果与有些学者研究的MALT1影响Thl7细胞的致炎性 作用相似综上所述，MALT1在EAE小鼠发病中有极其重要的作用, 其机制可能是由于MALT1是NF-kB通路激活过程中一个重 要的中心环节，并通过激活NF-kB而上调IL-17在血清中 的含量，进而引起自身免疫性脱髓鞘病变。

进一步研究如何 抑制MALT1的表达或者抑制其激活NF-kB通路，可以为今 后探索MS的治疗靶点提供新思路参考文献［1］ 王超，刘广志，高旭光•多发性硬化的T细胞研究进 展［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2009, 16 (2)： 151-152.［2］ 袁锦楣.临床神经免疫学［M］.北京：北京科学技术出版社，1992： 123.[3] Baxter A G.The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]・ Nature Reviews Immunology, 2007, 7 (11)： 904-912.[4] Steinman L, Zamvil S S・ Virtues and pitfalls ofmultipleEAE for the development of therapies forsclerosis [J]. TrendsImmunol, 2005, 26 (11)：565-571.[5] Nakae S, Komiyama Y , Nambual. Antigen-specificT cell sensitization isimpairedin lL-17-deficientmice , causing suppression ofallergic cellular and humoral responses[J]・Immunity,2002, 17 (3)： 375-387.[6] Baeuerle P A, HenkelT. Function and octivation of NF-kappaB in the immune system[J]. Annu Rev Immunol, 1994，12 (1 )： 141-179._7] Me Guire C , Wieghofer P , Elton L , et al. Paracaspase MALT1 deficiency protects mice from autoimmune-mediated demyelination[J]. The Journal of Immunology, 2013, 190 (6)： 2896-2903.[8] Br ti stle A, Brenner D, Knobbe C B, et al. The NF- k B regulator MALT1 determines the encephalitogenic potential of Th17 cells[J]. J Clin Invest, 2012, 122 (12)： 4698.[9] Vallabhapurapu S , Karin M. Regulation and function of NF- k B transcription factors in the immune system [J]. Annu Rev Immunol, 2009, 28 (27 )： 693-733.[10] 董为伟•神经保护的基础与临床[M].北京：科学出 版社，2009： 222-238・[11] Korn T, Mitsdoerffer M, Croxford A L, et al. IL-6 controls Thl7 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells [J]・Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105 (47)： 18460-18465.[12] Codarri L, Gy ti lv e szi G, Tosevski V, et al. ROR gammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoiinmune neuroinf lammation[J]・ Nat Immunol, 2011, 12 (6)： 560-567.(收稿日期：2014-03-14)(本文编辑：欧丽)。