SOD、CAT、POD等的活性测试方法.doc

SOD、CAT、POD测定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四卩坐光化还原法)1、 试剂的配制(1) 0. 05mol/L 磷酸缓冲液(PBS, pI17. 8):A 母液:0. 2mol/L 磷酸氢二钠溶液:取 Na2HP04*12H20 (分子量 358. 14) 71. 7g； B母液：0. 2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2P04・2H20 (分子量156.01) 31. 2go 分别用蒸憾水定容到1000ml o0. 05mol/L PBS (pH7. 8)的配制：分别取 A 母液(Na2HP04) 228. 75ml, B 母液 (NaII2P04) 21.25ml,用蒸纟留水定容至 1000mlo(2) 14. 5mM甲硫氨酸溶液:取2. 1637g Met用磷酸缓冲液(pH7. 8)定容至1000ml3) 30 uM EDTA-Na2溶液：取0. 001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mlo(4) 60 PM核黄素溶液：取0. 0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保 存5) 2.25mM氮蓝四哩(NBT)溶液：取0. 1840g NBT用PBS定容至100ml,避光 保存。

酶液制备：取0.2g (可视情况调整)样詁(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷 的研钵中，加入2nd 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7・8)在冰浴上研磨成匀浆, 转入离心管中在4°C、12000g下离心20min,上清液即为酶液2、 酶活性测定(1) 反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml, EDTA-Na2溶液0. 6ml,磷酸缓冲液5.4ml, NBT溶液6ml,核黃素溶液6ml,混合后摇匀；(2) 分别取3ml反应混合液和30P1酶液于试管中(3) 将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30 u 1 PBS (不加酶液) 照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零4) 以不照光的对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后，避光测0D560(出现 颜色即可测定)5) 酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化述原50%所需酶量(测的样品 值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量)为1个酶活单位(U) OSOD 总活性=/ (l/2AckXWXVt)SOD比活力=SOD总活性/蛋口质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW)；比活力单位以IW单位每毫克蛋白 表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml, 1.6ml,加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量(ml, 30ul) ； W为样 品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体的质量mg);蛋白质含量单位为mg/go 二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。

1、 过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)(1) 试剂配制：0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH6・0):分别取A母液(Na2HP04 ) 123ml和B母液(NaII2P04 ) 877ml 混匀即为 1000ml PBS(O. 2M, pH6. 0)；(2) 反应混合液配制(以60个样为准):取200ml PBS (0. 2M, pH6. 0),加入0. 076ml液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基 酚)加热搅拌溶解，冷却后加入0. 112ml 30%的H202,混匀后保存于冰箱中备 用3) 样品测定：取3ml反应液并加入30 u 1酶液，以PBS为对照调零，而后测定0D470值(测定 40秒)边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证 每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大)每30S读数一次4) 酶活性计算：以每min 0D值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u) POD 二(AA470XVt) / (WXVsXO. 01 X t) (u/g min)AA470：为反应吋间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g)； t为反应吋间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml, (1.6ml) ； Vs为测定时取用酶液体积(ml, 30ul) o2、 过氧化氢酶(CAT)活性测定(1) 试剂配制：0. 15mol/L 磷酸缓冲液(pH7. 0)：取 A 母液(Na2HP04) 457. 5 ml 和 B 母液(NaH2P04) 292. 5 ml混合后用蒸憎水定容至1000ml o(2) 反应液配制:取 200ml PBS (0. 15M, pH7. 0),加入 0. 3092ml 30%的 H202(原液)摇匀即可。

3) 样品测定：取3讷反应液加入0. 1ml (可视情况调整)酶液，以PBS为对 照调零，测定0D240 (紫外)(测定40s) o(4) 酶活性计算：以每min 0D值减少0.01为1个酶活性单位(u)CAT二/ (WXVsXO.OIXt) (u/g min)AA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)； t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml, 1.6ml) ； Vs为测定时取用酶液体积(ml, 0. 1ml) o。