（新编）银染方法总汇及注意事项.doc

ptotocol 是这样的，请看哪里不妥：蛋白银染步骤步骤 溶液 时间固定 甲醇 100ml冰醋酸 25ml加双蒸水至 250ml 30min冲洗 双蒸水 3 次敏化 甲醇 75ml戊二醛（25%w/） 1.25ml硫代硫酸钠(5%w/) 10ml醋酸钠（17g） 加双蒸水至 250ml 30min冲洗 双蒸水 3 次银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至 250ml 20min冲洗 双蒸水 2 次显色 碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/) 0.05ml加双蒸水至 250ml2-5min终止 EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至 250ml 10min冲洗 双蒸水 3 次建议使用 silia 的方法！！简单，快！本人的银染方法：1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20 分钟；2. 50％EtOH 洗 PAGE 胶三次，每次 20 分钟；3. 预处理：0.02％ Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O 漂洗三次，每次 20 秒；5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO 处理 PAGE 胶 20 分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％ Na2S2O3, 漂洗 10－15 分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10 分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和 silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正谢谢！！！5.2.2.3 银染色1 银染液 1（1000ml） ： 甲醇 50％ 乙酸 12％ 甲醇 500ml 冰醋酸 120ml 2 银染液 2（1000ml）： 甲醇 30％，乙酸钠 0.4M，戊二醛 0.5%，硫代硫酸钠 0.1%， （含乙酸 1－2ml ）甲醇 300ml 乙酸钠 54.4g 戊二醛 10ml 硫代硫酸钠 1g 乙酸 1－2ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠 2.5% 甲醛 0.02% 无水碳酸钠 25g， 甲醛 1.5ml4 硝酸银（100ml）： 20%硝酸银 （过滤后待用）染色步骤：1 银染液 1 洗 2 次， 每次 5 分钟2 银染液 2 洗 1 次，每次 30 分钟3 超纯水 洗 2 次， 每次 1 分钟4 0.5%硝酸银 洗 30 分钟5 超纯水洗 5 次，每次 1 分钟 （关键步骤，共计 5 分钟）显色液显色 6 看到各条带，则倾去显色液, 1％ 乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色但水洗不充分又可能导致背景较深。

我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右固定液：50% 乙醇，10% 冰醋酸，40%水浸泡液：30% 乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛 0.625ml，0.2% NaS2O3•5H2O银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛终止液：1.46% EDTA-2Na•2H2Osilia wrote:我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：1） PAGE 胶切下后用 50％乙醇（ 100ml 左右）洗三次，每次 20 分钟2） 2％硫代乙醇酸钠稀释 50 倍作用 1 分钟，双蒸水洗 3 次，每次 20 秒3） 2％硝酸银稀释 10 倍作用 20 分钟，双蒸水洗 3 次，每次 20 秒4） 6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗5）加中止液 10％乙酸中止即可银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种但是其准确的染色机制还不是特别的清楚大致的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于 1 ng/蛋白质点，故广泛的用在 2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，对关键操作及要求做了补充！主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋 白的检测！如内源性 GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染银染的详细机制还不是非常清楚试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min 或者更长时间 100ml 乙醇 40% 乙醇25ml 冰醋酸 10% 冰醋酸 加水到 250ml致敏：30min 75ml 乙醇 30% 乙醇17g 乙酸钠 28.2g 三水乙酸钠0.5g 硫代硫酸钠加水到终体积 250ml 水洗：3 x 10min 银染：20min 0.625g AgNO3100 ul 37%甲醛 （在使用前加入）加水到终体积 250ml 水洗： 2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定 6.25 g Na2CO350 ul 37% 甲醛 （在使用前加入）加水到终体积 250ml终止：10min 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者 1g 甘氨酸加水到终体积 250ml 保存：1% 冰醋酸，4 ℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗 30min，以免胶太脆而破碎。

2． 甲醛在使用前加入3． 最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰4． 显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度5． 银染液和显色液需要预冷6． 所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！7． 清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm ）可以提高灵敏度2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净如果凝胶被过度银染，可用 Rapid Fix 脱色，并用考马斯亮蓝二次染色3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择 40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于 1 μS 的去离子水7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。

8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100 和两性电解质这些干扰性物质10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果12. SDS 凝胶中的巯基乙醇会导致在 60 KDa 或 67 KDa 处出现两条水平线减少巯基乙醇的用量即可避免13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高 40 倍14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。