1引物设计程序.doc

引物设计程序（利用primer premier 5.0软件）1. 从程序中打开primer premier 5.0软件，并将目的基因调出 （可利用file菜单中的子菜单，利用new菜单复制粘贴选择新的基因片段，或利用open菜单从程序中找出目的基因）2、 设计前的准备工作1） 进行引物设计时，一般有两种引物：一是不带酶切位点 的引物；二是带酶切位点的引物一般从基因组中进行 PCR扩增目的基因、而且不知道该目的基因扩增的难易 程度时，建议设计不带酶切位点的引物如已知目的基 因比较容易从基因组中扩增，则可以直接带酶切位点 或如从质粒上扩增目的基因，则可以直接带酶切位点2） 选择限制性酶切位点时，需考虑实验室己有的载体材料， 即利用实验室的载体工具进行引物设计3） 利用Primer中的enzyme菜单，判断目的基因中是否含有 所选载体中可被限制性内切酶识别的位点；若存在，则 这些酶不可用4） 针对一个具体的载体确定可用的限制性酶种类后，还需 考虑以下几方面：I、所选的两个酶的位置最好不要距离 太近（特别是相邻的），否则加重错误引发的机率或是切 割不完全；II、同时选择的两种酶最好有相同的Buffer（不 同公司的产品，其Buffer会有所不一样，一般以宝生物公司的产品为准），以提高酶切效率、减少劳动量；III、 尽可能地用具有粘性末端的限制性内切酶；IV、尽可能 地减少载体上的基因序列连入目的基因上，即尽可能地 减少工程蛋白中外来氨基酸的数量；V、利用蛋白纯化标 签的位置是目的蛋白的前面还是后面，或前后均具有。

5） 确定所用的限制性酶种类后，还需额外分析一下酶切位 点的粘性末端是否会配对，如&/ I与X/zr? I酶切后的粘 性末端能相互配对，则不可同时使用，否则导致载体自 连6） 确定所用的限制性酶种类后（结果记录到引物设计文档 中），还需特别注意前面酶切位点的密码子阅读框架，尤 其是后面一个酶切位点的如扩增的基因带终止密码子， 则只需考虑前面的即可，后面的不需考虑；如不带终止 密码子，则更需要特别注意后面酶切位点的阅读框架 有的需要补一个碱基或删除两个碱基，具体的再具体分 析这一点需要特别注意！！！7） 完成以上工作后，才可以开始进行引物设计3. 在点击primer菜单前，如需设计带酶切位点的引物，还需 在目的基因前后各加上至少10个碱基，碱基的具体种类 随意；引物不带酶切位点则不需要加4、 点击primer菜单，即可进行引物设计S为有义链引物（正引物），A为反义链引物（反引物），一般程序默认长度为25个（可自我设定）5、首先点击S，然后点击Edit Primers菜单，进行引物编辑状态，可删减或添加碱基1）带酶切位点时将限制性内切酶的序列输入相应的位置，紧挨目的基因的序列；如用M/el时，可与目的基因共用 ATG三个碱基；2） 带有酶切位点的引物，在引物的5’末端需加四个保护碱 基，具体的碱基种类可结合调Tm值时再调整。

3） 依据 Haipir （引物发夹）、dimer （二聚体）、Flase Priming（错误引发）的具体情况进行添加或删减碱基：一般尽 可能地不要存在发夹，或能值在2.0以内；dime和错误 引发的能值最好在15以内，不要超过20;4） 设计好后，点击Analyze菜单，能后再点击Prime菜单， 再点击OK菜单，即可设计好正引物6、点击A，将目的基因序列下面的移动符拉到序列最末端， 将鼠标放置序列上，在离末端25个碱基处点击一下，即 出现引物序列，然后再点击Edit Primers菜单，进行引物 编辑状态，可删减或添加碱基1） 酶切位点的序列应是相配对的反序列（3’-5’）；2） 带有酶切位点的引物，在引物的5’末端需加四个保护碱 基，具体的碱基种类可结合调Tm值时再调整3）可以直接删除碱基、或直接在5’端添加碱基（应目的基因还有未配对的碱基，否则不能直接加）；4）有的Primer软件可以在3’端加碱基，但有的不能，则需返回点击Edit Primers之前，将引物移动到25个碱基之 前，然后再进行碱基编辑才可以；5）修改完后，也点击Analyze菜单，能后再点击Prime菜单，再点击0K菜单，即可设计好反引物。

7、回到Primer Premier界面后，检查正反引物的长度、产率、GC 含量、Tm 值、发夹、dimer、Flase Priming 等，进一步 修改正反引物修改时需注意以下几方面：1） 最好不要有发夹结构，或在2.0以下，越小越好2） 引物长度一般不少于15个；3） 在有酶切位点时，目的基因配对的碱基不少于15个，质 粒做载体时可以少些4） 引物末端一般为G或C为好，Tm值在40C_60C之间 为好5） dimer 在 15 以下，cross dimer 同8、引物的保存1）在Primer Premier界面中，选择Edit菜单中子菜单Copy， 分别将正反引物复制粘贴到自己的引物设计文档中，记 住，所粘贴出的序列均是从5’到3’2）利用电脑键盘上的PrtScSysRq键盘抓图，能后粘贴到引 物设计文档中；3）引物需标明设计时间，并按自己的需要对正反引物命名; 带酶切位点时注明限制性内切酶的序列位置及名称，并 注明计划使用的载体9、发送引物序列去合成选择上海生工作为引物合成单位，需按该公司的要求发 送引物合成单考虑到2 OD合成量与5 0D合成量的价 格一样，可合成5OD，每管分装成1OD。

一般合成周期 为4天。