超氧阴离子产生速率测定.doc

超氧阴离子产生速率测定羟氨氧化法(王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57)一、原理植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如 O2·¯、OH· 、O 2 等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱 H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡二、材料、仪器设备与试剂(一) 材料植物叶片、花瓣等器官(二)仪器设备低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架(三)试剂(1)0.05 mol·L-1 磷酸缓冲液 PH=7.8(0.66304g 的 NaH2PO4.2H2O 和 16.3849g 的Na2HPO4.12H2O 定溶 1000mL，校正 PH)(2)10m mol·L-1 盐酸羟胺(NH 2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g 定溶到 500mL，(冷)(3)17m mol·L-1 对氨基苯磺酸(C 6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C 6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到 500mL，( 冷，磁)(4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g 定溶到 500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全)三、试验步骤(1)制做亚硝酸根标准曲线 2mL 系列浓度的 NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入 4mL 对氨基苯磺酸和 4mLa－萘胺于25℃保温 20min，然后测定 OD530 以［NO 2－ ］和测得的 OD530 值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线(2)取 0.2g 植物材料，加入 1.0mL 0.05 mol·L-1 磷酸缓冲液(PH7.8) 于冰浴研磨(3)研磨物以 12000r/min 离心 15min，取上清液 0.5mL 加入 0.5mL 磷酸缓冲液和 1mL 10m mol·L-1 盐酸羟胺，25℃静置 1h(4)加入 1mL17m mol·L-1 对氨基苯磺酸和 1mL7m mol·L-1α-萘胺，25℃静置 20min，测其 530 处 OD 值四、计算根据测得的 OD 值，查标准曲线将花瓣中氧自由基含量的 OD 值转换成[NO 2－ ]，依据羟胺与 O2－ 的反应式： NH2OH+2O2－ +H+→NO 2－ +H2O2+H2O从[NO 2－ ]对[O 2－ ]进行化学计算，将[NO 2－ ]乘以 2 得到[O 2－ ]。

五、注意：加样的顺序不能颠倒，25℃是它的反应温度。