芹菜素对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响.docx

    芹菜素对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响    【摘要】目的：研究芹菜素(apigenin,AP)对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响，并初步探讨其降血糖的作用机制方法：复制链脲佐菌素(STZ)致糖尿病小鼠模型将50只昆明鼠随机分为5组，分别是正常对照组、模型组、AP低(5mg·kg-1)、中(10mg·kg-1)和高(20mg·kg-1)剂量治疗组，治疗组每日腹腔注射给药，连续30d采用血糖仪检测空腹血糖；ELISA法检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；RT-PCR法检测胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达结果：AP可显著降低糖尿病模型小鼠血糖，提高SOD活性，减少MDA含量，抑制胰腺MCP-1mRNA表达(P<0.05,P<0.01)，并具有药物剂量依赖性结论：AP对STZ引起的高血糖有很好的降血糖作用，其作用机制可能与其降低氧化应激水平和抑制MCP-1的表达相关关键词】芹菜素;糖尿病;氧化应激;超氧化物歧化酶;丙二醛;单核细胞趋化蛋白-1TheEffectofApigeninonOxidativeStressandMonocyteChemoattractantProtein1inDiabeticMiceYangChaoYue【Abstract】Objectiv:Tostudytheeffectofapigeninonoxidativestressandmonocytechemoattractantprotein1indiabeticmice,andexploreitsmechanismofhypoglycemosis.METHODS:Ddiabeticmicemodelwasestablishedbystreptozotocin(STZ).Fiftykunmingmicewerepidedintofivegroupsrandomly,includingnormalcontrolgroup,modelcontrolgroup,APlowdose(5mg·kg-1)treatmentgroup,APmiddledose(10mg·kg-1)treatmentgroupandAPhighdose(20mg·kg-1)treatmentgroup.TheAPtreatmentgroupswereadministratedAPi.p.dailyforthirtydayscontinuously.Fastingbloodglucosewastestedbyglucosemeter;theactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andthelevelofmalondialdehyde(MDA)inbloodserumweretestedbyELISA;theexpressionofmonocytechemoattractantprotein1(MCP-1)mRNAinpancreaswastestedbyRT-PCR.RESULTS:APcandecreasethecontentofbloodglucose,increasetheactivityofSOD,lowerthelevelofMDA,inhibittheexpressionofMCP-1mRNAinadose-dependentmannerindiabeticmiceinducedbySTZsignificantly(P<0.05,P<0.01).CONCLUSION:APhasagoodhypoglycemiceffectondiabeticmiceinducedbySTZ,anditsmechanismmayberelatedtolowerthelevelofoxidativestressandinhibittheexpressionofMCP-1.【Keywords】Apigenin;diabetes;oxidativestress;superoxidedismutase(SOD);malondialdehyde(MDA);chemoattractantprotein1(MCP-1)R141A1005-0515(2011)06-0030-02糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，其确切的病因和发病机制尚未完全阐明[1]。

目前的研究认为，糖尿病的发生发展与自由基介导的机体氧化损伤和抗氧化防御系统清除自由基能力的平衡失调密切相关[2]糖尿病又可以被看作是一种炎症性疾病，即氧化应激反应中蕴含着炎症反应[3]以上关于糖尿病发病机制认识的突破性进展为糖尿病治疗提供了新的思路芹菜素(apigenin,AP)是一种黄酮类化合物，具有降血压、抗炎、抗肿瘤、抗氧化和清除自由基等作用[4]目前，AP广泛应用于肿瘤治疗的研究中，具有抑制和治疗多种肿瘤的潜能[5,6]，而在其它疾病中的应用少有研究本研究采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病模型小鼠，观察芹菜素对糖尿病小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响，探讨其对糖尿病模型小鼠降血糖的治疗机理1仪器与材料1.1仪器:680型酶标仪和PowerPacBasic型电泳仪(美国Bio-RAD公司)；MG48G型基因扩增仪（杭州朗基）；Megafuge1.0R型低温离心机（德国Herculeus公司）；优越型血糖仪（德国罗氏）；BIO-PRO凝胶成像分析系统（美国西盟(SIM)公司）1.2试药:芹菜素(AP)和链脲佐菌素(STZ)（美国Sigma公司）；小鼠丙二醛(MDA)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(货号：GS-E20347)和小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(货号：GS-E20348)（上海工硕生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；100bpDNAmarker和PCRTaq（大连宝生物工程有限公司）；revertaidfirststrandcDNAsynthesiskit（MBIfermentas公司）；PCR引物由上海英俊生物技术有限公司合成；其它试剂为国产分析纯试剂。

1.3动物:昆明小鼠，体重22~25g，由广西医科大学实验动物中心提供，试验动物生产许可证：SCXK(桂)2003-00032方法2.1糖尿病模型小鼠制备[7]:小鼠禁食自由饮水12h后，按150mg·kg-1剂量一次性腹腔注射STZ(用0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液新鲜配制成15mg·mL-1溶液，现配现用，冰浴保存)注射后的小鼠自由饮水、进食标准饲料3d后动物禁食，自由饮水12h，采取尾静脉血测定小鼠全血血糖值，空腹血糖值均在大于11.1mmol·L-1的小鼠为糖尿病模型小鼠2.2实验动物分组及治疗措施:实验分为正常对照组、糖尿病模型组、AP治疗组（分为低剂量组(5mg·kg-1)、中剂量组(10mg·kg-1)和高剂量组(20mg·kg-1)），每组各10只小鼠每天上午禁食2h后腹腔注射给药：AP治疗组分别按5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1体质量给药，糖尿病模型组和正常对照组腹腔注射等容量蒸馏水，连续给药30d2.3血糖测定:于开始给药后30d20:00p.m.禁食12h（不禁水），次日8:00a.m.断尾法取血（肝素抗凝）测定空腹血糖血糖测定采用德国罗氏优越型血糖仪，具体操作严格按照仪器使用说明。

2.4血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测:与“2.3”同步眼球取血（非肝素抗凝），室温静止1h，离心(3000r·min-1,5min)，获取血清，按ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行操作即待测样品50L与50L的生物素标记的抗体于反应孔内混匀，37℃温育1h，洗涤；加入80L亲和链酶素-HRP，混匀，37℃温育30min，洗涤；加入底物A和B各50L，混匀，37℃温育10min；加入50L终止液，立即用酶标仪在波长450nm测定各孔的吸光度A值并同步做标准曲线，样品中MDA和SOD含量根据其A值由标准曲线换算出相应的浓度2.5胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA检测:与“2.3”同步获取胰腺，按Trizol试剂说明提取胰腺总mRNA使用一步法RT-PCR，逆转录合成cDNA后进行PCR扩增MCP-1基因逆转录反应条件：65℃5min；42℃1h；72℃5minPCR扩增条件：94℃3min后进行30个循环扩增(94℃30s；55℃40s;72℃30s)；72℃10min，以β-actin为内参照小鼠MCP-1基因序列的上游引物为5′ACCCTTACACACATCAGCA3′，下游引物为5′CTACCATCAGCACAACAAAGA3′，产物大小为447bp；β-actin上游引物为5′GTAAAGACCTCTATGCCAACAC3′，下游引物为5′CTAGGAGCCAGAGCAGTAATC3′，产物大小为100bp。

扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶(含1mg·L-1EB)电泳，电泳结果采用凝胶成像分析系统成像，并通过quantityone软件计算MCP-1与β-actin条带灰度比值，以表示样本中MCP-1相对mRNA水平2.6统计学方法:数据用SPSS10.0软件分析，以均数±标准差(X±s)表示，n为例数，多组间比较用one-wayANOVA，两组间比较用非配对Student'st-test，P<0.05表示差异有统计学意义3结果3.1AP对糖尿病小鼠血糖的影响:模型对照组小鼠在建模后30d，空腹血糖值为21.76±1.39mmol·L-1，明显高于正常对照组(P<0.01)经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，血糖显著下降(P<0.05和P<0.01)，具有药物剂量依赖性其中，以20mg·kg-1AP连续给药30d，血糖下降幅度最大，其血糖值为8.35±0.52mmol·L-1，属于正常范围(≤11.1mmol·L-1)AP对糖尿病小鼠血糖影响见表1与正常对照组比较:*P<0.01；与模型对照组比较:**P<0.05；与模型对照组比较:#P<0.013.2AP对糖尿病小鼠MDA含量和SOD活性的影响:将一系列不同浓度的标准品与测定的对应A值作标准曲线,并进行直线相关回归分析,得出MDA直线回归方程为Y=0.04+0.009X,r=0.997；SOD直线回归方程为Y=0.02+0.01X,r=0.998（浓度为横坐标(X)，A值为纵坐标(Y)）。

将样品测得的A值代入相应的直线回归方程中,即得到相应的含量模型对照组小鼠在建模后30d，与正常对照组相比，血清中MDA含量明显升高，而SOD活性明显下降(P<0.01)，分别为29.31±1.07nmol·mL-1和35.78±1.17IU·mL-1经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，MDA含量显著下降，而SOD活性显著上升(P<0.05和P<0.01)，并具有药物剂量依赖性AP对糖尿病小鼠MDA含量和SOD活性的影响见表23.3AP对糖尿病小鼠胰腺MCP-1mRNA表达的影响:正常对照组小鼠胰腺MCP-1在mRNA水平上检测不到其表达，而模型对照组小鼠在建模后30d，胰腺MCP-1mRNA的表达显著上升(P<0.01)，其DNA条带灰度比值为2.68±0.24经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，MCP-1DNA条带灰度比值显著下降，即MCP-1mRNA的表达显著下降(P<0.01)，并具有药物剂量依赖性AP对糖尿病小鼠胰腺MCP-1mRNA表达的影。