LI640040叶绿素荧光使用简易手册.docx

Gene Company Limited基因6400-40 叶绿素荧光叶室简易使用手册〔基因农业环境科学部，2023，北京〕本手册是在总结了美国LI-COR 公司 6400-40 使用手册的根底上，简明扼要地论述了荧光叶室的使用方法，仅供参考限于作者的理论水平和应用阅历，本文还存在很多缺乏之处，具体使用请 参见厂家原版英文说明书，本人及本公司不担当由本手册引起的任何责任另外需要提示您的是， 请在使用本仪器和阅读本手册之前阅读我们为您预备的叶绿素荧光测量技术的背景学问综述，这对您最终理解我们的仪器使用和预备试验设计来说是必需的1. 前言：植物叶片所吸取的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光三个过程之间存在竞争，任一效率增加都将造成另外两个产量下降因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息需要留意的是，这种测量永久是相对的，由于光线不行避开会有损失因此，全局部析必需把数据进展标准化处理，包括其进一步计算的很多参数也是如此调制荧光仪的消灭是荧光争论技术的创在这类仪器中，测量光源是调制〔高频率开关〕的， 其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光因此，相对的荧光产量可以在背景光线〔主要 是指野外全光照的条件下〕存在的条件下进展测量。

目前绝大多数的荧光仪承受了调制系统，同时 也猛烈建议您选择调制荧光仪叶绿素荧光可以说明光系统II 利用叶绿素吸取能量的程度和过量光线破坏的程度光系统II 电子流淌可以表现总体光合速率特征它供给我们在其他方法无法实现的状况下，快速估量植物光合 力气的潜在力气光系统 II 也被认为是光合机构中对光诱导破坏反响最为灵敏和最为脆弱的组分， 光系统 II 的破坏是植物叶片胁迫的最早表现固然，荧光技术本身也不是没有局限的，荧光最强有力的应用不是单独使用这一技术本身，而是结合其他技术，尤其是气体交换从而获得植物对环境响 应的完整解释6400-40 就是在这一应用需求的背景下推出的，是目前唯一可以同时同步测量叶绿素荧光与气体交换的仪器1Gene Company Limited基因2. 仪器硬件组成与功能6400-40 的全部硬件组分是在 6400 光合仪的根底上填加的设备全部 6400-40 放置在标记为6400-40 Fluorescence Chamber 的纸箱内主要包括以下组分：l 荧光叶室的上部：全部的光源与检测器在此局部包括活化光光源、闪光、远红外光和检测光及其检测器和光强检测器l 荧光叶室的下部：l 叶温热电偶：测量阔叶叶片的温度。

l LCF 连接线：用于连接叶室和主机的关心线3. 仪器连接〔英文手册中有图示说明，请参考之〕在该过程中，应当关闭LI-6400 或使LI-6400 处于休眠状态3.1 在 bundle 中安装cable有两种方法，一种是利用LCF 配件包中的velcro ties将LCF 电缆和LI-6400 的电缆捆绑在一起假设将长期利用 LCF，最好将 LCF 的 cable 插入到 bundle 中后一种花费的时间较长但当长期应用 LCF 时格外有意义3.2 去除 IRGA 分析器头部的上部和下部叶室利用 LI-6400 和 LCF 工具包中的 3/32 六角扳手将固定上部和下部叶室的长的螺丝撤除不再连接叶室上部和叶室下部的叶片温度探头〔图27-6〕3.3 连接 LCF 叶室的下面局部叶室底部的 3 个 O 形圈确定要放置好，并且将其连接到IRGA 分析器头部，接着安装叶片温度探头3.4 连接 LCF 的上面局部确认 O 形圈放置在应有的位置，并且连接LCF 的主体局部3.5 连接 cables在 IRGA 分析器头部插入小的 4 针的连接器，并且将 15 针的LCF 连接器与它的cable 相连接， 将这个cable 另一端的 37 针连接器插入到LI-6400 的操作平台上的关心接口上。

3.6 光合仪的其他组分连接不变2Gene Company Limited基因4. 手动测量包括荧光根本测量参数的测量，共有三种试验测量方法4.1 光化学效率的测量 Fv/Fm争论意义：Fv/Fm 对于大多数植物而言，LI-COR 认为，变化范围在0.75-0.85 之间，有的争论认为实际生长正常的植物大致在 0.83 左右假设我们测量得到的数值不在此正常范围，则首先我们应当确认我们的设置是否正确〔常规设置我们接下来将介绍〕，暗适应是否缺乏假设设置和处理正确，那么我们就可以结合其他数据，如气体交换得到的光合、蒸腾等指标来争论此植物是否处于某种环 境条件的胁迫或某特定的生长期〔如作物结实之后的枯黄阶段等〕也就是说，本测量值假设不在正 常范围，那么我们可以说此植物叶片不处于其正常的生长状况，但是缘由还需进一步试验来探究试验预备：此试验的关键之处在于 Fo 点的准确测量，这需要植物叶片完全的暗适应一般而言，20 分钟左右的遮光处理〔传统的方法一般承受锡纸来包裹植物叶片〕是足够的，但是最好的状况是24 小时暗适应或一个晚上，在凌晨破晓前测量〔在试验室内条件简洁把握，而在野外不是很便利〕目前一般承受暗适应夹子来处理，但是一般荧光仪的暗适应夹子由于是光纤测量，遮光的面积太小，而常识告知我们，小面积遮光对于整个植物叶片而言是缺乏的，LI-COR 的暗适应夹子〔请单独购置，200 美元一套。

每套 10 个〕大到足以掩盖整个叶片〔即使在测量时，非测量部位也是遮光的〕，这一点是其优点测量过程：l 硬件连接好后开机，选择“Default fluorometer”叶室配置文件，回车启动系统l 把叶片夹入叶室，关闭其他设置如光合测量一样，比方过滤管打到完全“Bypass”l 荧光参数设置：进入测量菜单，按“F1”来其文件名按数字 8，进入第 8 行菜单按 F2 进入 Flr Editor 菜单界面设置如下表：MearsurementsFalshIntensity 强度设定Modulation 调制频率设定Filter 信号平均频率Gain 放大倍数Duration 闪光持续时间10.25KHz1100.8 秒3Gene Company Limited基因Dark〔此设置在本试验中无用，但为以后试验设置便利起 见，一并设好〕Intensity 强度设定BlueModulation 调制频率设定Filter 信号平均频率Duration 远红外光持续时间Far Red Intensity 强度设定Far Red PreTimeFar Red PostTime Modulation 调制频率设定Filter 信号平均频率7，相当于 6000umol/s-1m-2 左右No change20KHz50KHz6 秒8〔相当于 6-7umol/s-1m-2 左右〕1 秒1 秒0.25KHz1Hzl 以上设置好后，按F5，OK 后弹出对话框“Store Changes”，按 Y 后存成自己起的固定设置文件名，如“LI-set001”后回车即可，以后不用再设置，只需要在第8 行菜单中按F1“FlrPik” 选择这一文件名后回车即可。

l 按字母“M”，把 M 行变量显示在屏幕上，等待变量dF/dT 稳定后〔小于±5 以内即可〕按数字 0 把菜单翻到 0 行，按F3“Do FoFm”来测量，按字母“N”来显示“Fo”“Fm”“Fv/Fm”的实际测量值，这时测量已经完毕，数据已自动记录到您起的文件名中，关闭文件l 接下来是重复测量和处理的问题了〔由于数据在不同叶片不同植株之间存在确定的差异，个别状况差异可能很大，这是自然现象，不是由于机器测量造成的，重复是必需的〕一般而言，一个处理按统计学严格需要 30-50 次重复固然这是常规的状况，同时需要考虑您的样品的多少和处理的多少以及测量消耗的时间，但是有一点可以确定的是，重复多的数据代表性好，更有 说服力l 数据处理：全部测量数据要通过方差分析来确定处理内差异和处理间差异，以比较说明不同处理之间的差异是否显著〔请参考生物统计学相关学问〕l 问题：胁迫增加还是削减了Fv/Fm？PSⅡ对环境胁迫如温度、干旱和辐射等格外敏感胁迫将 引起Fv/Fm 的降低影响荧光测量结果的因素主要包括叶龄、叶片安康状况和环境因子条件等4Gene Company Limited基因4.2 争论 PSⅡ的效率争论意义：PhiPS2〔也称为△F/Fm¹〕指 PSⅡ所吸取的光量子中用于光化学反响的比例，通过对光适应叶片〔某一光照条件下完全适应的叶片〕的测量而得到。

在低光照条件下，PSⅡ的量子产量 通常较高，由于叶片所吸取的光能中有较大的比例被用于光化学反响中；而在高光照强度条件下， 由于叶片所吸取能量中的很大比例通过非光化学过程而散失，所以经过高光照强度光适应的叶片的△F/Fm¹较低此数值也可进一步计算出电子传递速率〔ETR〕，这一数值与植物光合速率有很强的线性关系，是又一个表征植物光合作用力气凹凸的变量本试验一般用来争论植物在不同光强下的 光能利用力气试验预备：已经光照活化的植物样品在自然光条件下〔放入叶室后，需要把活化光强度设置成与 外界条件一样〕，测量不同植物种类的样品，来比较其差异假设我们想把握和转变光线条件，需要承受可以把握光强的卤素灯来照耀植物样品在野外条件不具备的状况下，可以承受6400-40 活化光来照耀，但是需要的时间比较长，这取决于植物的状况〔20-60 分钟都是有可能的〕测量过程：l 硬件连接好后开机，选择“Default fluorometer”叶室配置文件，回车启动系统l 把叶片夹入叶室，关闭按数字2 来进入第 2 行子菜单，按“F5”来设置光强和外界实际光强全都或您想要模拟的光强值其他设置如光合测量一样，比方过滤管全打到完全“Bypass”。

l 荧光参数设置：进入测量菜单，按“F1”来起文件名按数字 8，进入第 8 行菜单按 F2 进入 Flr Editor 菜单界面设置如下表〔只有三项有所转变〕：MearsurementsIntensity 强度设定Modulation 调制频率设定Filter 信号平均频率Gain 放大倍数Duration 闪光持续时间Intensity 强度设定520KHz1100.8 秒8Falsh BlueModulation 调制频率设定Filter 信号平均频率No change 20KHz50KHzl 以上设置好后，按F5，OK 后弹出对话框“Store Changes”，按 Y 后存成自己起的固定设置文件名，如“LI-set002”后回车即可，以后不用再设置，只需要在LEVEL8 中按F1“FlrPik”选5Gene Company Limited基因择这一文件名后回车即可l 按字母“M”，把M 行变量显示在屏幕上，等待变量dF/dT 稳定后〔小于±5 以内即可，对于设置光强与外界条件不全都的状况需要很长的时间〕按数字 0 把菜单翻到 0 行，按 F。