实验四DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 DNA限制性,酶切,和琼脂糖凝胶,电泳,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列,-G,AATT C-,-C TTAA,G-,实验原理-,限制性内切酶及酶切反应,BamH I Restriction Enzyme,识别序列：,-G,GATC C-,-C CTAG,G-,Hind III Restriction Enzyme,识别序列：,-A,AGCT T-,-T TCGA,A-,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：,pH范围：7.58.0,缓冲液组份:,Tris(三羟甲基氨基甲烷）、,NaCl、,MgCl,2,、,温育温度：37,反应体系：,DNA (1ug或更少)5ul,10 x Buffer 2ul,Restriction Enzyme 3ul,H,2,O,10ul,Total 20ul,混匀，37度保温30分钟,实验原理-,琼脂糖凝胶电泳,电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程琼脂糖凝胶电泳,是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质琼脂糖,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,琼脂糖浓度(%),线型DNA分子的分离范围(Kb),0.3,560,0.6,120,0.8,0.810,0.9,0.57,1.2,0.96,1.5,0.23,12.0,0.12,电泳法的优点,凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离样品用量少设备简单可在室温进行操作简便，费时不多,不同类型的电泳，有不同的用途改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率1、TAE电泳缓冲液,Tris-base,冰醋酸,EDTA,2、琼脂糖凝胶（0.8%）,琼脂糖：0.8g,TAE：100ml,试剂,3、溴化乙锭(ethidium bromide，EB),EB染色液工作液浓度：0.010.03mg/ml,EB,是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光4、6 x Loading Dye,组成,0.25%bromophenol blue（深蓝色）,0.4%orange G（黄色）,10mol/L Tirs-HCl(pH7.5),50mol/L EDTA,使用量,5份DNA样品溶液加1份Blue/6xLoading Dye,操 作 步 骤,一、酶切反应,反应体系：,DNA 5ul,10 x Buffer 2ul,Hind III 3ul,H,2,O 10ul,Total 20ul,混匀，37度保温30分钟,二、电泳,。

1、电泳前的准备工作,轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中2、制 胶,(,1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入 30ml电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化2)每组将琼脂糖液冷却到约70,轻轻倒入胶槽，并插 上梳子凝固约30min.(3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳3、点样和电泳,9 8 7 6 5 4 3 2 1,9 8 7 6 5 4 3 2 1,(1)将酶切产物、自制DNA与6 x Loading Dye混,合，每个样品混合后体积均为24ula.自制DNA 20,ul+,4ul Loading Dye,b.酶切产物 20,ul,+4ul Loading Dye,(2)将标准DNA/Hand III、DNA、酶切产物、自制,DNA各10ul点入点样孔3)电泳4)EB染色10min,注意不要污染实验室环境）,-DNA/,Hind III,Markers片段大小（bp）和电泳带型示意图,点样孔,23130,9416,6557,4361,2322,2027,4、紫外分析仪下看胶,23130,2322,2027,9416,6557,4361,警告,胶染色和观察时一定要带手套！,EB（溴化乙锭）诱变！,结果记录与分析,绘制电泳图谱,。